摘要

1.原位雜交（ISH）是一種廣泛使用的方法，用于定位和定量各種細胞學和組織學制劑中的DNA或RNA，并保留細胞和組織的形態(tài)。

2.ISH是一種極其靈活的技術。事實上，可以選擇DNA或RNA探針，這些探針可以帶有放射性、熒光或抗原標記的堿基，進而進行顯色（CISH）或熒光檢測（FISH）。

3.該技術的最新進展克服了其主要局限性：靈敏度，尤其是在檢測單拷貝目標時。Enzo Life的AMPIVIEW™ RNA探針采用LoopRNA ISH™技術，是檢測組織和細胞中核酸靶標最靈敏的方法之一，而且不會破壞樣本的形態(tài)。

 

簡介

原位雜交（ISH）是一種廣泛使用的方法，用于定位和定量細胞學制備物（中期染色體涂片、細胞、組織）甚至全胚胎（WMISH）中的DNA或RNA。它的正式誕生可追溯到1969年，當時兩個獨立的研究小組使用體內產生的放射性標記RNA作為探針，檢測爪蟾卵母細胞核中的互補DNA（1,2）。第一代探針所使用的放射性標記技術看起來很有前途，但由于許多限制因素，如標記所使用同位素的半衰期本身較短，或更重要的是與放射性有關的安全和環(huán)境問題，其應用一直相當有限。自這些開創(chuàng)性工作以來，分子生物學技術的巨大進步使ISH越來越實用，用途也越來越廣泛。如今，ISH已成為一種重要的實驗室工具，常規(guī)應用于從基礎研究到臨床診斷和預后等多個領域。為了實現(xiàn)這種靈活性，人們可以選擇DNA或RNA探針，它們可以帶有熒光或抗原標記的核苷酸。檢測方法是顯色（CISH）還是熒光（FISH），也可根據(jù)所需的分析類型進行調整，其中CISH更適用于分子病理學診斷，可同時觀察目標和標本形態(tài)，而FISH通常是多重分析和基因組畸變研究的首選。
 

本綜述將介紹ISH基本原理，該技術的最新進展，并說明這些進展如何在個性化醫(yī)療時代進一步擴大ISH的應用范圍。

 

ISH工作原理

具體方案嚴格取決于樣品類型、研究目的、探針性質和所選檢測方法，ISH程序可歸納為幾個要點：

探針生成：在雜交階段作為誘餌使用的探針是與相關序列互補的DNA或RNA片段。在合成過程中，可以通過加入與標記物共軛的核苷酸對其進行標記。

標本制備：將感興趣的細胞或組織固定保存。組織通常嵌入石蠟并切成薄片。然后將標本固定在玻璃載玻片上并進行滲透，使探針能接觸到目標序列。

變性：樣本中的探針和核酸都會受熱變性，為隨后的雜交階段做好準備。

雜交（或退火）：包括探針與樣本中的互補 DNA/RNA 序列自發(fā)配對。

檢測：探針與其目標物之間形成的雜交可以利用不同類型的標記進行可視化。

如下所述，根據(jù)研究目標的不同，需要采用不同的探針類型和檢測方法。

 

探針類型

雜交可以在互補的脫氧核苷酸或核糖核苷酸之間進行，因此可以使用DNA或RNA探針來定位特定樣本中的DNA或RNA。然而，這些不同類型的探針并不等同，我們必須為實驗選擇最合適的方案。例如，RNA-RNA雜交探針比RNA-DNA雜交探針更穩(wěn)定，而RNA-DNA雜交探針又比DNA-DNA雜交探針更穩(wěn)定。根據(jù)ISH目標的不同，穩(wěn)定性的差異會影響探針性質的選擇。
 

DNA探針是含有相關染色體區(qū)域特異核苷酸序列的DNA片段。其最常見的合成方法之一是切口平移反應，分兩步進行（圖1A）。首先，用低濃度的DNAse I酶處理模板DNA（通常是細菌人工染色體[BAC]），使其隨機缺口，產生一個游離的3′-OH基團。在第二步中，DNA聚合酶I將通過5'-3'外切酶活性去除核苷酸，同時拉長3'-OH基團，后者將作為引物。然后，反應混合物中經過修飾的核苷酸將被整合到新合成的鏈中，從而對探針進行標記。聚合酶鏈反應（PCR）是合成DNA探針的另一種常用方法：可以在有適當標記引物的情況下擴增感興趣的序列（末端標記PCR，圖1B），或者在反應混合物中加入標記的dNTPs，使反應產物在合成過程中被標記（連續(xù)標記PCR，圖1C）。基于DNA的ISH更常用于檢測細胞核中的特定DNA序列，例如識別潛在的基因擴增、缺失、易位和染色體數(shù)目。
 

RNA探針是一段單鏈RNA，用于通過雜交檢測互補核酸序列的存在。RNA探針可通過體外轉錄高效、穩(wěn)定地生成。常用的方法是在兩個方向相反的啟動子之間克隆要轉錄的DNA，以便使用適當?shù)木酆厦负铣捎辛x或反義RNA。在這種情況下，RNA探針在轉錄過程中會通過加入修飾的核苷酸而不斷被標記，從而產生標記加入度很高的探針（圖1D）。此外，由于RNA探針是由線性化模板合成的，因此所有探針分子的長度都是一致的。與DNA探針相比，RNA探針具有信號更強的優(yōu)勢。然而，由于RNA本身的易變性和易受RNase降解的影響，RNA探針必須與其他任何RNA制劑一樣小心處理。RNA ISH主要用于研究細胞水平的基因轉錄和基因表達。

 

圖1.DNA探針（A-C）和RNA探針（D）最常用的合成方法。

 

標記類型和檢測方法

如前所述，ISH探針是用熒光團或抗原修飾的核苷酸標記的。這種差異與檢測方法有關。
 

含熒光團的探針可在熒光原位雜交（FISH）中直接進行熒光檢測。FISH是一種高靈敏度的技術，可以使用不同的熒光團來觀察同一標本上的多個目標位點。FISH可用于染色體制圖和計數(shù)，以及檢測結構重排，如易位、倒位、插入和缺失。然而，當需要組織形態(tài)學信息時，F(xiàn)ISH可能會受到限制，因此染色體檢測可能是首選。
 

CISH（顯色原位雜交）通常與間接檢測和使用生物素或地高辛標記探針有關。
 

生物素是放射性標記核苷酸的第一個替代物，因為它可以利用其與親和素或鏈霉親和素的高親和力結合，進而與報告酶[堿性磷酸酶（AP）或辣根過氧化物酶（HRP）]結合顯色。生物素也可被特異性抗體識別，其下游檢測系統(tǒng)與IHC/IF基本相同。不過，生物素探針標記可能會導致染色問題，尤其是在內源性大量表達生物素的組織中，如肝、腎、骨骼肌和心肌等。
 

針對這一問題，與地高辛結合的探針是一種有效的替代方法。地高辛是一種從洋地黃屬植物中提取的類固醇抗原(3)。由于它只存在于這些植物中，因此避免了生物素可能帶來的背景問題。檢測是通過與抗地高辛抗體特異性結合進行的。此外，地高辛和生物素標記還可以在多重檢測中結合使用，例如，可以同時使用兩種不同的原位探針，或者將顯色ISH與IHC結合使用。

 

用于單分子可視化的RNA ISH的進展

早期診斷和個性化治療是現(xiàn)代醫(yī)學面臨的兩大挑戰(zhàn)。因此，DNA、RNA和蛋白質生物標記物的定量和定性分析在臨床實踐中的作用日益突出，為診斷、預后和治療指導提供了重要信息（4）。基于DNA的ISH和IHC通常應用于這一領域，而基于RNA的ISH仍僅限于高表達基因（如EBER1/2）（4），其主要局限在于該技術的靈敏度，尤其是在檢測單拷貝目標時。例如，通過使用“經典”RNA ISH，宮頸陰道涂片中HPV的檢測很容易被漏掉，因為感染通常是由標本中少量細胞中病毒基因組的單一整合引起的（5）。因此，RT-PCR通常被認為是臨床診斷（以及任何研究領域）基因表達分析的黃金標準，因為它可以檢測到非常有限的相關序列。然而，與ISH不同的是，RT-PCR需要將樣本均質化以提取DNA/RNA，因此無法提供有關基因表達的任何空間信息。
 

為了克服這些局限性，多年來人們不斷改進ISH技術，試圖提高其靈敏度。最常見的方法是通過使用支鏈DNA（bDNA）（4,6）來增強檢測能力，其最普遍的應用是使用成對的Z-探針（或雙Z-探針）。如圖2所示，Z-探針由三個元素組成：與目標RNA互補的序列（雜交所必需）、間隔物（連接物）和Z-探針尾部。Z探針與前置放大器序列配對，后者又與多個放大器結合。最后，幾種標記探針（顯色或熒光）附著在放大器分子上的特定位點上(7)。只有當兩個Z探針同時與目標物退火時，才能進行檢測，而信號放大過程可使靈敏度極高，從而確保了該系統(tǒng)的特異性。
 

圖2.成對的Z-探針放大技術示意圖。

 

盡管這種形式的bDNA技術有許多明顯的優(yōu)勢，但它的某些方面仍然會構成制約。例如，由于擴增需要多個步驟，因此程序相當長。雜交條件也可能很苛刻，從而改變組織或影響其他標記的可視化。最后，它的總體成本較高，較小的實驗室不太容易使用。

 

AMPIVIEW™ RNA探針

Enzo Life自1986年開發(fā)出第一款用于ISH的非放射性HPV探針以來，一直被視為標記和檢測領域的先驅，如今再次推出基于LoopRNA專利技術的 AMPIVIEW™ RNA探針，為該領域做出進一步貢獻。如圖3所示，在LoopRNA ISH探針（LRP）中，與目標序列配對的區(qū)域穿插著多個與目標序列不互補的RNA間距片段。這些間隔的設計使其大部分堿基可以用生物素或地高辛標記。當這種探針與目標序列雜交時，標記的間隔區(qū)段就會環(huán)出，然后就能被報告系統(tǒng)識別（5）。由于存在多個生物素或地高辛分子，報告基因很容易通過環(huán)路接觸到這些分子，從而使信號得到強力放大，確保了極高的靈敏度。由于雜交無需經過多個擴增步驟，因此與上述bDNA系統(tǒng)相比，雜交過程更快、更簡便。此外，AMPIVIEW™探針不需要任何特殊設備，可用于手動或自動程序。
 

關于檢測，與標準的ISH檢測一樣，可以是直接或間接檢測。當探針用生物素標記時，可直接使用與報告酶連接的鏈霉親和素（直接或一步式方案）。在間接（或兩步）方案中，抗生物素或抗地高辛抗體可和即用型POLYVIEW® PLUS AP或 HRP檢測試劑結合使用，產生高強度顯色，染色清晰。

 

圖 3. AMPIVIEW™ RNA 探針設計和信號放大方式簡圖。

 

Enzo Life的第一批AMPIVIEW™ RNA探針是針對HPV的。La Rocca博士等人證明，基于LoopRNA技術的ISH探針可以檢測HPV DNA和RNA，甚至可以檢測到單拷貝基因組整合的HPV。這些結果與另一種市售的雙Z探針進行了比較，表明AMPIVIEW™ RNA探針具有同等或更優(yōu)越的性能(5)。文章還強調了LoopRNAs 的另一個相關特性，即可以合成與有義序列（與病毒基因組DNA互補）和反義序列（與基因組DNA和RNA轉錄本互補）相對應的探針，以便區(qū)分基因組DNA和病毒主動轉錄的RNA。
 

AMPIVIEW™ RNA探針實際上可以針對任何基因組中的任何基因進行設計。例如，在COVID-19大流行期間，俄亥俄大學的Nuovo博士使用AMPIVIEW™探針檢測了COVID-19患者不同組織中SARS-CoV-2 RNA的表達，比較了病毒基因組的存在和四種特征性病毒蛋白（包膜、穗、膜和核帽）的存在（8）。

 

參考文獻:

1.Gall JG & Pardue ML. Formation and detection of RNA-DNA hybrid molecules in cytological preparations. PNAS (1969). PMID: 4895535.

2.John HA et al. RNA-DNA hybrids at the cytological level. Nature (1969). PMID: 5799530.

3.FarrellJr RE. Nucleic Acid Probe Technology. RNA Methodologies, Ch 12. (2020). Full Text.

4.Wang F et al. RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. J Mol Diagn (2012). PMID: 22166544.

5.La Rocca G et al. Recent improvements in in situ hybridization for the detection of HPV infections in clinical samples. WCRJ (2020). Full Text.

6.Player AN et al. Single-copy gene detection using branched DNA (bDNA) in situ hybridization. J Histochem Cytochem. (2001). PMID: 11304798.

7.Atout S et al. Evaluation of the Suitability of RNAscope as a Technique to Measure Gene Expression in Clinical Diagnostics: A Systematic Review. Mol Diagn Ther (2022). PMID: 34957535.

8.Nuovo GJ et al. A Standardization Protocol for the In Situ Detection of SARS-CoV2 RNA and Proteins. Appl Immunohistochem Mol Morphol. (2022). PMID: 35175238.