細(xì)胞傳代實(shí)驗(yàn)原理及常見三類具體過程
細(xì)胞傳代實(shí)驗(yàn)原理：當(dāng)培養(yǎng)的細(xì)胞增殖達(dá)到一定密度后，將會(huì)出現(xiàn)密度抑制現(xiàn)象，表現(xiàn)為細(xì)胞的生長(zhǎng)和分裂速度逐漸減慢，甚至停止。貼壁細(xì)胞會(huì)在培養(yǎng)瓶中長(zhǎng)成致密單層 (懸浮細(xì)胞會(huì)充滿整個(gè)體積的培養(yǎng)液)，鋪滿培養(yǎng)瓶底部，此時(shí)如果不及時(shí)進(jìn)行分裝再培養(yǎng)，即傳代培養(yǎng)，細(xì)胞將逐漸走向衰老、死亡，將培養(yǎng)的細(xì)胞從一個(gè)容器以適當(dāng)比率轉(zhuǎn)移到其他容器中擴(kuò)大培養(yǎng)，稱為傳代培養(yǎng)。細(xì)胞在培養(yǎng)過程中不斷增殖，培養(yǎng)皿/瓶空間有限，當(dāng)細(xì)胞接觸過密，生長(zhǎng)就會(huì)受到抑制，影響細(xì)胞狀態(tài)，因此我們要把其中一部分細(xì)胞分到別的培養(yǎng)皿/瓶里。
一、 貼壁細(xì)胞傳代（以一個(gè)T25瓶為例）
1、 吸出原培養(yǎng)液；
2、 加入2ml左右PBS，輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)瓶潤(rùn)洗細(xì)胞，吸出PBS丟棄；
3、 加入1ml左右胰酶，輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)瓶使之浸潤(rùn)所有細(xì)胞，放入培養(yǎng)箱消化；
4、 消化時(shí)間跟據(jù)細(xì)胞特性有所不同，顯微鏡下看到細(xì)胞塊中間的細(xì)胞明顯分離變圓，側(cè)立培養(yǎng)瓶細(xì)胞可以滑落時(shí)可終止消化，全程不要拍打培養(yǎng)瓶；
5、 加入3ml含血清的培養(yǎng)基終止消化，吹打細(xì)胞使之脫落并在液體里反復(fù)吹打使細(xì)胞，使之盡量呈單顆細(xì)胞的懸浮液，這時(shí)可以在顯微鏡看下；
6、 收集細(xì)胞懸液離心，1200rpm（約250g） 3分鐘，離心完吸出上清丟棄。
7、 加入新鮮培養(yǎng)基，吹打幾下混勻細(xì)胞即可，按需接種到新培養(yǎng)瓶，補(bǔ)足培養(yǎng)基，擰松瓶蓋或使用透氣瓶蓋進(jìn)行培養(yǎng)。
8、 檢查培養(yǎng)箱二氧化碳，溫度和水盤。
二、 懸浮細(xì)胞傳代（以一個(gè)T25瓶為例）
1、 輕輕吹散懸浮細(xì)胞，部分貼壁松散的懸浮細(xì)胞可直接吹打培養(yǎng)瓶底部使細(xì)胞懸浮，收集細(xì)胞懸液到無菌離心管中，離心1200rpm（約250g） 3分鐘，離心完畢吸出上清丟棄;
2、 加入適量新鮮培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，按比例接種至培養(yǎng)瓶（接種比例按實(shí)際情況，不確定可計(jì)數(shù)后再接種）;
3、 常規(guī)細(xì)胞推薦以3~5×105cells/ml傳代，長(zhǎng)到2×106cells/ml傳出;
4、 建議剛開始幾代計(jì)數(shù)后傳代，后面可以根據(jù)經(jīng)驗(yàn)按比例傳代。
三、 半貼壁半懸浮細(xì)胞傳代（以一個(gè)T25瓶為例）
1、 培養(yǎng)液（含懸浮的細(xì)胞）：用移液器吸出培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移到無菌離心管中；
2、 貼壁部分：用1ml PBS洗細(xì)胞，吸出PBS放入到第1步裝有培養(yǎng)液的離心管中收集（不要直接丟棄，里面有細(xì)胞）；
3、 培養(yǎng)瓶加入胰酶1ml，放入培養(yǎng)箱靜置消化；
4、 消化時(shí)間跟據(jù)細(xì)胞特性有所不同，顯微鏡下看到細(xì)胞明顯收縮變圓，側(cè)立培養(yǎng)瓶細(xì)胞可以滑落時(shí)可終止消化，全程不要拍打培養(yǎng)瓶；
5、 用3ml含血清的培養(yǎng)基終止消化，將消化下來的細(xì)胞懸液吹散細(xì)胞后收集到第1步的離心管；
6、 將離心管在1200rpm（約250g） 3min離心，離心完畢棄掉上清，加入新的培養(yǎng)基重懸，按實(shí)際情況分瓶，放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)。
溫馨提示：
1、 每丟棄一個(gè)液體前都要想一下里面有沒有可能有細(xì)胞，避免丟失細(xì)胞。
2、 細(xì)胞種類、細(xì)胞密度、細(xì)胞狀態(tài)、甚至胰酶的品牌，均影響到細(xì)胞的消化時(shí)間，所以消化的時(shí)候不要只看時(shí)間，以顯微鏡下細(xì)胞的狀態(tài)來確定消化終點(diǎn)，部分難消化的細(xì)胞消化時(shí)間甚至可以長(zhǎng)達(dá)15分鐘。
3、 細(xì)胞的傳代比例通常說的是等體積的容器，不同容器需要換算；例如：一個(gè)T25培養(yǎng)瓶的細(xì)胞傳到一個(gè)10cm培養(yǎng)皿里面，雖然是1傳1，但是比例可不是1:1；T25瓶底面積25cm2，10cm培養(yǎng)皿底面積約為55cm²（10cm的培養(yǎng)皿指的是培養(yǎng)皿的外徑，而培養(yǎng)皿的內(nèi)徑約為8.4cm，故根據(jù)內(nèi)徑可求出其底面積為55cm²），所以實(shí)際傳代比例為1:2.2。
4、 在有關(guān)離心機(jī)的實(shí)驗(yàn)中，標(biāo)準(zhǔn)的離心條件應(yīng)該是用RCF(relative centnifugal fieldt)來衡量，而在實(shí)際大家實(shí)驗(yàn)過程中，往往習(xí)慣用rmp即每分鐘轉(zhuǎn)速來表示；RCF即表示相對(duì)離心場(chǎng)，以重力加速度g(980.66cm/s2)的倍數(shù)來表示；RCF=1.119×10-5×(rpm)2×r（其中r表示離心機(jī)轉(zhuǎn)軸中心與離心管中心的距離，單位為cm）；所以每個(gè)實(shí)驗(yàn)室離心機(jī)轉(zhuǎn)速設(shè)置是不一樣的，常規(guī)建議1200rpm 大約250g。
一、 貼壁細(xì)胞傳代（以一個(gè)T25瓶為例）
1、 吸出原培養(yǎng)液；
2、 加入2ml左右PBS，輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)瓶潤(rùn)洗細(xì)胞，吸出PBS丟棄；
3、 加入1ml左右胰酶，輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)瓶使之浸潤(rùn)所有細(xì)胞，放入培養(yǎng)箱消化；
4、 消化時(shí)間跟據(jù)細(xì)胞特性有所不同，顯微鏡下看到細(xì)胞塊中間的細(xì)胞明顯分離變圓，側(cè)立培養(yǎng)瓶細(xì)胞可以滑落時(shí)可終止消化，全程不要拍打培養(yǎng)瓶；
5、 加入3ml含血清的培養(yǎng)基終止消化，吹打細(xì)胞使之脫落并在液體里反復(fù)吹打使細(xì)胞，使之盡量呈單顆細(xì)胞的懸浮液，這時(shí)可以在顯微鏡看下；
6、 收集細(xì)胞懸液離心，1200rpm（約250g） 3分鐘，離心完吸出上清丟棄。
7、 加入新鮮培養(yǎng)基，吹打幾下混勻細(xì)胞即可，按需接種到新培養(yǎng)瓶，補(bǔ)足培養(yǎng)基，擰松瓶蓋或使用透氣瓶蓋進(jìn)行培養(yǎng)。
8、 檢查培養(yǎng)箱二氧化碳，溫度和水盤。
二、 懸浮細(xì)胞傳代（以一個(gè)T25瓶為例）
1、 輕輕吹散懸浮細(xì)胞，部分貼壁松散的懸浮細(xì)胞可直接吹打培養(yǎng)瓶底部使細(xì)胞懸浮，收集細(xì)胞懸液到無菌離心管中，離心1200rpm（約250g） 3分鐘，離心完畢吸出上清丟棄;
2、 加入適量新鮮培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，按比例接種至培養(yǎng)瓶（接種比例按實(shí)際情況，不確定可計(jì)數(shù)后再接種）;
3、 常規(guī)細(xì)胞推薦以3~5×105cells/ml傳代，長(zhǎng)到2×106cells/ml傳出;
4、 建議剛開始幾代計(jì)數(shù)后傳代，后面可以根據(jù)經(jīng)驗(yàn)按比例傳代。
三、 半貼壁半懸浮細(xì)胞傳代（以一個(gè)T25瓶為例）
1、 培養(yǎng)液（含懸浮的細(xì)胞）：用移液器吸出培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移到無菌離心管中；
2、 貼壁部分：用1ml PBS洗細(xì)胞，吸出PBS放入到第1步裝有培養(yǎng)液的離心管中收集（不要直接丟棄，里面有細(xì)胞）；
3、 培養(yǎng)瓶加入胰酶1ml，放入培養(yǎng)箱靜置消化；
4、 消化時(shí)間跟據(jù)細(xì)胞特性有所不同，顯微鏡下看到細(xì)胞明顯收縮變圓，側(cè)立培養(yǎng)瓶細(xì)胞可以滑落時(shí)可終止消化，全程不要拍打培養(yǎng)瓶；
5、 用3ml含血清的培養(yǎng)基終止消化，將消化下來的細(xì)胞懸液吹散細(xì)胞后收集到第1步的離心管；
6、 將離心管在1200rpm（約250g） 3min離心，離心完畢棄掉上清，加入新的培養(yǎng)基重懸，按實(shí)際情況分瓶，放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)。
溫馨提示：
1、 每丟棄一個(gè)液體前都要想一下里面有沒有可能有細(xì)胞，避免丟失細(xì)胞。
2、 細(xì)胞種類、細(xì)胞密度、細(xì)胞狀態(tài)、甚至胰酶的品牌，均影響到細(xì)胞的消化時(shí)間，所以消化的時(shí)候不要只看時(shí)間，以顯微鏡下細(xì)胞的狀態(tài)來確定消化終點(diǎn)，部分難消化的細(xì)胞消化時(shí)間甚至可以長(zhǎng)達(dá)15分鐘。
3、 細(xì)胞的傳代比例通常說的是等體積的容器，不同容器需要換算；例如：一個(gè)T25培養(yǎng)瓶的細(xì)胞傳到一個(gè)10cm培養(yǎng)皿里面，雖然是1傳1，但是比例可不是1:1；T25瓶底面積25cm2，10cm培養(yǎng)皿底面積約為55cm²（10cm的培養(yǎng)皿指的是培養(yǎng)皿的外徑，而培養(yǎng)皿的內(nèi)徑約為8.4cm，故根據(jù)內(nèi)徑可求出其底面積為55cm²），所以實(shí)際傳代比例為1:2.2。
4、 在有關(guān)離心機(jī)的實(shí)驗(yàn)中，標(biāo)準(zhǔn)的離心條件應(yīng)該是用RCF(relative centnifugal fieldt)來衡量，而在實(shí)際大家實(shí)驗(yàn)過程中，往往習(xí)慣用rmp即每分鐘轉(zhuǎn)速來表示；RCF即表示相對(duì)離心場(chǎng)，以重力加速度g(980.66cm/s2)的倍數(shù)來表示；RCF=1.119×10-5×(rpm)2×r（其中r表示離心機(jī)轉(zhuǎn)軸中心與離心管中心的距離，單位為cm）；所以每個(gè)實(shí)驗(yàn)室離心機(jī)轉(zhuǎn)速設(shè)置是不一樣的，常規(guī)建議1200rpm 大約250g。
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