“長生不老”一直是神話故事、電影小說里必不可少的題材。從幾千年前的秦始皇百煉丹，到現(xiàn)在科學家們探索和研究，無一不展現(xiàn)了人類對于抵抗衰老的執(zhí)著以及對衰老背后秘密的渴求。到底是怎么樣的機制調控衰老，我們又是否可以突破時間的牢籠…本文以細胞衰老的不同類型和檢測方法，為大家介紹目前研究已經(jīng)觸及到的細胞衰老的秘密。

衰老（Senescence），來自拉丁語senex，是指在對各種應激反應后細胞發(fā)生不可逆的生長停滯，同時伴隨功能的失調。我們有理由認為人類的衰老至少有一部分是由于細胞衰老引起的，想在人體內進行研究是幾乎不可能的，但是細胞水平的變化我們是可以把控的。最早對于細胞衰老的定義是基于倫納德·海夫利克對人類胚胎成纖維細胞的體外培養(yǎng)，他發(fā)現(xiàn)其增殖到50代左右便終止增殖，即以永久性增殖停滯為顯著特征。大部分物種正常體細胞在體外培養(yǎng)時都不能無限分裂，在分裂一定的次數(shù)后處于靜止狀態(tài)，而這個次數(shù)也被稱為“海夫利克極限”。

衰老的分類

在整個生命過程中，細胞會遇到外源性和內源性的刺激。根據(jù)細胞類型、刺激性質和強度，細胞會選擇三種途徑：修復、死亡或衰老。基于應激發(fā)生的細胞衰老可分為復制性衰老（端粒）和應激過度的早衰，不同類型的刺激誘導細胞的衰老具有相同的衰老表型（如圖1）。

圖1 不同的壓力源導致的細胞衰老[1]
 

 復制性衰老

在目前的細胞培養(yǎng)過程中，細胞衰老可以用細胞的群體倍增次數(shù)來量化（注：群體倍增次數(shù)（population doubling (PD or pd) number）是細胞種群數(shù)量翻倍的近似數(shù)。例如，當傳代的細胞分裂比例為1:2時，傳代數(shù)與PD數(shù)相等；傳代的細胞分裂比例為1:4時，傳代數(shù)等于2 PDs，以此類推）。細胞的類型、種類和供體年齡都是細胞培養(yǎng)過程中影響群體倍增數(shù)量的決定因素。端粒是覆蓋在染色體末端的重復DNA序列，保護DNA不被降解或重組，從而維持基因組穩(wěn)定。由于DNA聚合酶無法復制DNA的末端，所以端粒會隨著復制的次數(shù)增加而逐步被侵蝕，導致端粒達到臨界長度，從而觸發(fā)DNA損傷，阻滯細胞周期進程并誘發(fā)衰老。因此解決端粒的縮短可能可以作為人類抗衰老的方法。

圖2 端粒結構示意圖（圖源網(wǎng)絡）

 

 應激誘導的早衰

除復制性衰老，還有一系列非端粒的刺激因素導致細胞過早衰老，且與端粒的長度無關。“早衰”即指在復制衰老發(fā)生的最大群體倍增次數(shù)之前，衰老就已經(jīng)出現(xiàn)，即衰老的進程發(fā)生了加速。這些應激包括內源性和外源性，包括活性氧（ROS）產(chǎn)生的氧化應激、基因毒性應激和癌基因的過度激活等。端粒體內外應激的重要靶點，相比于氧化應激和基因毒性應激，癌基因誘導的衰老不影響端粒的長度，即不喪失復制潛能。

 

 細胞衰老的標志物分析

衰老細胞會與正常細胞在某些方面表現(xiàn)出一定的差異性（如圖3），我們可以通過不同的方法進行體外鑒定。沒有任何標志物是衰老細胞特有的，也不是所有的衰老細胞都表達所有的細胞衰老標志物。

圖3 細胞衰老的特征[1]
 

 BrdU 細胞增殖實驗

5-溴-脫氧尿嘧啶核苷 (Bromodeoxyuridine，BrdU)是一種胸腺嘧啶核苷的類似物。當細胞處于細胞周期中的 DNA 合成期 (S 期) 時，BrdU 可以摻入到新合成的 DNA 中。利用抗 BrdU 的單克隆抗體熒光染色，就可通過流式細胞術檢測 BrdU 的含量，從而定量細胞群體的增殖情況。細胞衰老的一個重要標志是細胞周期的穩(wěn)定停滯G1/S期，因此BrdU細胞增殖實驗是一種快速、簡便、靈敏度高的檢測細胞增殖活力的方法。

 知識小貼士：細胞周期的介紹  

細胞周期（cell cycle）是指細胞從一次分裂完成開始到下一次分裂結束所經(jīng)歷的全過程，分為間期與分裂期兩個階段。間期又分為三期，即DNA合成前期（G1期）、DNA合成期（S期）與DNA合成后期（G2期）。細胞的生命開始于產(chǎn)生它的母細胞的分裂， 結束于它的子細胞的形成，或是細胞的自身死亡。通常將子細胞形成作為一次細胞分裂結束的標志，細胞周期是指從一次細胞分裂形成子細胞開始到下一次細胞分裂形成子細胞為止所經(jīng)歷的過程。在這一過程中，細胞的遺傳物質復制并均等地分配給兩個子細胞。     

圖4 細胞周期（圖源網(wǎng)絡，僅供參考）

 

● G1期（first gap）從有絲分裂到DNA復制前的一段時期，又稱合成前期，此期主要合成RNA和核糖體。該期特點是物質代謝活躍，迅速合成RNA和蛋白質，細胞體積顯著增大。這一期的主要意義在于為下階段S期的DNA復制作好物質和能量的準備。

● S期（synthesis）即DNA合成期，在此期，除了合成DNA外，同時還要合成組蛋白。DNA復制所需要的酶都在這一時期合成。

● G2期（second gap）為DNA合成后期，是有絲分裂的準備期。在這一時期，DNA合成終止，大量合成RNA及蛋白質，包括微管蛋白和促成熟因子等。

 

 衰老相關β-半乳糖甘酶

β-半乳糖苷酶，一種廣為人知的衰老標志物，簡直就是“C位大咖”。1995年，Dimiri等人發(fā)現(xiàn)，除了在pH 4.0的條件下可以檢測到溶酶體的β-半乳糖苷酶，老化的細胞還會在pH 6.0檢測到β-半乳糖苷酶，稱為衰老相關的β半乳糖苷酶（Senescence-Associated β-galactosidase ，SA-β-gal）。

圖5 β-半乳糖苷酶檢測細胞衰老情況（圖源網(wǎng)絡）

 

常規(guī)細胞衰老β-半乳糖苷酶染色試劑盒是一種基于衰老時SA-β-gal活性水平上調而對衰老細胞或組織進行染色檢測的試劑盒，以X-Gal（5-溴-4氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷）為底物，在pH 6.0條件下，衰老特異性的β-半乳糖苷酶催化會生成藍綠色產(chǎn)物，從而在光學顯微鏡下觀察到變成藍色的表達β-半乳糖苷酶的細胞或組織。一般不會染色衰老前的細胞、靜止期細胞、永生細胞或腫瘤細胞等。

研究表明，SA-β-gal的表達與溶酶體體積和數(shù)量的增加密切相關。脂褐素（lipofuscin），是溶酶體作用后不再能被消化的物質而形成的殘余體。已經(jīng)有試驗驗證，脂褐素組織化學蘇丹黑B（Sudan Black B，SBB）模擬物標記染色與SA-β-gal在衰老細胞中具有共定位的效果，是衰老細胞體外檢測另一種指標。

值得注意的是，并不是所有細胞的衰老都表達SA-β-gal，比如GM1神經(jīng)節(jié)苷脂貯積癥是β-半乳糖苷酶缺乏而引起的一種遺傳性溶酶體疾病，其患者的成纖維細胞在衰老狀態(tài)不表達SA-β-gal。

 

 衰老相關的異染色質

異染色質（heterochromatin）是指在細胞周期中具有固縮特性的染色體。衰老的開始會產(chǎn)生不同染色質結構的積累，稱為衰老相關的異染色質病灶（senescence associated heterochromatin focal SAHF）。衰老細胞的DNA包含異染色質的點狀結構域，很容易與非衰老細胞的染色質進行區(qū)分。

染色質重組與衰老相關的異染色質病灶（SAHF）形成和持續(xù)性 DNA 損傷可用于鑒定衰老細胞。

圖6 常規(guī)和異常染色質的區(qū)別（圖源網(wǎng)絡）

SAHF 的標志物可以通過DAPI即4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole)與DNA強力結合的熒光染料檢測，或者相關蛋白比如異染色質蛋白 1（HP1） 和 賴氨酸 9 二或三甲基化組蛋白 H3（H3K9Me2/3） 等進行免疫組化檢測。盡管SAHF在衰老時經(jīng)常觀察到，但一些細胞出現(xiàn)衰老時并不形成SAHF。

核纖層蛋白B1（Lamin B1）是核纖層蛋白家族重要成員之一，其主要功能在于維持細胞核骨架完整性，并通過影響染色體分布、基因表達及DNA損傷修復等參與細胞的增殖和衰老，其表達量的下調是細胞衰老的另一個重要特征。 

圖7 核纖層蛋白BI免疫熒光結果（圖源網(wǎng)絡）

 

 衰老相關分泌表型

衰老細胞會分泌大量的因子，包括促炎細胞因子和趨化因子、生長調節(jié)劑、血管生成因子和基質金屬蛋白酶等，統(tǒng)稱為衰老相關分泌表型（Senescent Associated Secretory Phenotype, SASP）。SASP是衰老細胞的另一個典型標志之一，它介導了許多衰老細胞的病理生理效應，促進細胞與周圍環(huán)境的交流，最終影響衰老細胞的命運。

圖8 細胞衰老相關分泌表型（圖源網(wǎng)絡）

在細胞衰老進程中，SASP的分泌是一個動態(tài)過程, 可分為以下三個階段：第一階段在DNA損傷后立即開始，并持續(xù)36 h，但不足以導致衰老；第二階段是“早期”SASP的形成，在誘發(fā)細胞衰老后數(shù)天，開始出現(xiàn)最重要的SASP因子，例如IL-1α；第三階段是“成熟”SASP的形成，在接下來的4~10天內，通過正反饋回路對轉錄進行調控，使大多數(shù)因子的分泌增加，最終形成“成熟”的SASP。

圖9 細胞衰老相關分泌表型的變化情況（圖源網(wǎng)絡）

 

目前已有很多SASP相關的研究，且對SASP調節(jié)途徑的研究不斷豐富。但仍需在SASP通路、分子之間的內在聯(lián)系，以及SASP影響衰老及衰老相關疾病的具體機制等開展大量研究。

 

 基因表達的改變

在細胞衰老過程中，基因表達會發(fā)生極端變化，尤其是細胞周期抑制和細胞周期激活的相關基因。細胞周期蛋白依賴激酶（CDKs）和細胞周期蛋白（Cyclins）是整個細胞周期調控機制中的核心分子，衰老細胞中Cyclins的相關基因表達會被抑制，而CDKs會被過度表達。因此，這些基因表達的是衰老細胞的常見標志。

例如p21能夠與一種細胞周期蛋白(cyclin)、某幾種細胞周期蛋白依賴性激酶(cyclin-dependent kinase,CDK)——比如CDK2，CDK4或CDK6構成復合體，抑制CDK的激酶（磷酸化酶）活性，細胞周期從而被阻礙在G1期而不能進入S期，導致不可逆轉的細胞周期停滯。

細胞衰老過程中基因表達模式存在多個動態(tài)變化軌跡，存在保守性，且不同衰老類型中存在較大的異質性。近年來關于該方面的研究也層出不窮，對細胞衰老過程中基因表達模式及變化規(guī)律提供了更多的新認識。

圖10 細胞周期蛋白與激酶的介紹（圖源網(wǎng)絡）

 

 結語

在體內，由于衰老細胞存在于各種組織中。不同組織的狀態(tài)、細胞衰老類型都有所區(qū)別，所以目前還沒有針對衰老細胞的絕對特異性的單一標志物。除了我們熟知端粒學假說，近幾年有學者基于端粒DNA和核糖體DNA(rDNA)能夠結合多種蛋白質影響p53的發(fā)現(xiàn)，提出細胞端粒DNA和核糖體DNA(rDNA)共調控假說。

細胞衰老的積累導致多種疾病的產(chǎn)生，比如癌癥、阿爾茲海默癥等，其涉及的信號通路更是數(shù)不勝數(shù)。人類對于衰老的研究從古至今，熱情不減，相信只要人類還沒永生，衰老將會是永恒的研究熱點。

 

參考文獻：

[1] Mohamad Kamal NS, Safuan S, Shamsuddin S, Foroozandeh P. Aging of the cells: Insight into cellular senescence and detection Methods. Eur J Cell Biol. 2020 Aug;99(6):151108.