前列腺癌是男性泌尿生殖系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，在全球，前列腺癌的發(fā)病率在男性所有惡性腫瘤中高居第2位，僅次于肺癌。免疫檢查點分子轉(zhuǎn)化生長因子受體II（TGFβRII）、T細胞免疫球蛋白和粘蛋白結(jié)構(gòu)域3（TIM3）與前列腺癌的細胞免疫抑制有關(guān)，因此免疫治療作為一種新的治療方法逐漸表現(xiàn)出巨大的前景。

CAR-T治療又稱嵌合抗原受體T細胞治療，是將人的T細胞經(jīng)過基因工程手段體外修飾改造后，回輸患者體內(nèi)，達到治療疾病的目的。CAR-T療法作為癌癥的突破性治療手段，一直以來備受業(yè)內(nèi)外人士關(guān)注，隨著國內(nèi)第四款CAR-T產(chǎn)品獲批上市，CAR-T療法熱度持續(xù)升溫。

近日，皖南醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院（弋磯山醫(yī)院）泌尿科和精準醫(yī)學中心的部分研究人員在《International Immunopharmacology》期刊上發(fā)表了題目為 “Dominant negative TGFβ receptor II and truncated TIM3 enhance the antitumor efficacy of CAR-T-cell therapy in prostate cancer” 的研究論文。該研究發(fā)現(xiàn)DT-PSMA-CAR-T細胞顯示出根除PSMA陽性的前列腺癌細胞的能力。此外，在體外移植GAL9-PSMA-PC3 細胞的免疫缺陷型小鼠實驗中，DT-PSMA-CAR-T細胞也顯示出消除腫瘤組織的能力，延長生存期，沒有顯著的副作用。
 

圖片來源：《International Immunopharmacology》
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圖1 CAR-T細胞的生產(chǎn)

研究結(jié)果 03
1. CAR-T細胞的生產(chǎn)制備并進行表型分析鑒定
首先，作者進行了CAR-T細胞的培養(yǎng)擴增并對其進行了表型分析。分為(i)UTD T細胞，(ii)PSMA-CAR-T細胞和(iii)DT-PSMA-CAR-T細胞。電穿孔后T細胞的擴增，質(zhì)粒的插入對T細胞的擴增有影響。檢測了分選后的T細胞上TIM3和TGFβRII的表達情況，三組T細胞的CD4和CD8表型，以及代表記憶T細胞的標記物CD45RO�？偟膩碚f，三組T細胞的表型是相似的。
 

圖2 DT-PSMA-CAR-T的制備及表型鑒定

2. 腫瘤殺傷實驗確定DT-PSMA-CAR-T強大抗腫瘤能力
作者分別研究了三組T細胞對TGFβRII和TIM3單獨作用及TGFβRII和TIM3聯(lián)合應(yīng)用后的抗腫瘤效率。

結(jié)果如下：
（1）DT可在體外消除TGFβRII對T細胞的抑制作用
在TGF-β濃度分別為0ng/ml和5ng/ml時，PSMA-CAR-T組和DT-PSMA-CAR-T組的腫瘤殺傷率相似（P>0.05）。在TGF-β濃度為20ng/ml和50ng/ml時，PSMA-CAR-T組的腫瘤殺滅率低于DT-PSMA-CAR-T組，在T細胞與靶細胞比例為1:1和5:1時差異更顯著（P≤0.05）。
 

圖3 不同TGF-β濃度對三組T細胞腫瘤殺傷效果對比

（2）DT可以消除TIM3對T細胞的抑制作用
在TIM3激活單克隆抗體濃度為10μg/ml和20μg/ml時，PSMA-CAR-T組的腫瘤裂解率低于DT-PSMA-CAR-T組，這與TGFβRII對T細胞的體外實驗影響相似。在T細胞與靶細胞比例為1:1和5:1時，差異更為顯著（P≤0.05)。
 

圖4 不同TIM3單抗?jié)舛葘?span style="color:rgb(102, 102, 102)">三組T細胞腫瘤殺傷效果對比

（3）DT可以消除TGFβRII和TIM3對T細胞的抑制作用

TGFβRII和TIM3之間存在協(xié)同效應(yīng)。當TGF-β和TIM3激活單克隆抗體聯(lián)合使用時，PSMA-CAR-T和UTD組對T細胞的抑制作用明顯強于TGF-β或TIM3單獨激活單克隆抗體（P≤0.05）。

圖5 TGFβRII和TIM3聯(lián)合使用對三組T細胞腫瘤殺傷效果對比

3. 動物實驗確定DT-PSMA-CAR-T可以消除TGFβR11和TIM3對T細胞的抑制作用
將DMEM-PSMA-PC3細胞皮下接種于小鼠背部。2周后，將所有小鼠隨機分為三組，分別靜脈靜脈注射（尾靜脈）：(i)UTD T細胞，(ii)PSMA-CAR-T細胞，(iii)DT-PSMA-CAR-T細胞。共觀察1個月，采用脊髓脫位法觀察未死于腫瘤的小鼠。每周通過腹腔注射熒光素進行生物熒光成像，并使用Aniview100（bolteng儀器）定量發(fā)光。

根據(jù)生物發(fā)光成像結(jié)果，UTD組有1只小鼠在T細胞輸注后存活28天，而CAR-T組的所有小鼠均存活。
 

圖6 DT-PSMA-CAR-T腫瘤殺傷體內(nèi)實驗

結(jié)論 04
實驗結(jié)果表明，在T細胞上過表達trTIM3和dnTGFβRII可以緩解TIM3和TGFβRII的免疫抑制作用，并在一定程度上改善了PSMA-CAR-T細胞的功能。作者認為靶向多個抑制性免疫檢查點是提高細胞免疫治療療效的一種方法，該策略有利于難治性和復(fù)發(fā)性腫瘤患者，促進細胞免疫治療產(chǎn)品的臨床應(yīng)用。

參考文獻：
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