產(chǎn)品及特點(diǎn)
虹彩病毒科宿主范圍廣泛，可感染脊椎動(dòng)物和無脊椎動(dòng)物，它們?cè)谒�生物種中廣泛分布，可能導(dǎo)致大規(guī)模損失。它可感染四脊滑螯蝦（Cherax quadricarinatus）、凡納濱對(duì)蝦（Litopenaeus vannamei）、羅氏沼蝦（Macrobrachium rosenbergii）、日本沼蝦（Macrobrachium nipponense）、克氏原螯蝦（Procambarus clarkii）、脊尾白蝦（Exopalaemon carinicauda）、中華絨螯蟹（Eriocheir sinensis）和粗腿厚紋蟹（Pachygrapsus crassipes）等。本產(chǎn)品就是以探針法熒光定量PCR技術(shù)為基礎(chǔ)開發(fā)的專門檢測(cè)蝦虹彩病毒的試劑盒，它具有下列特點(diǎn)：
■ 即開即用，用戶只需要提供樣品DNA模板。
■ 引物和探針經(jīng)過優(yōu)化，靈敏性高。
■ 提供陽性對(duì)照，便于區(qū)分假陰性樣品。
■ 特異性高，引物是根據(jù)蝦虹彩病毒DNA高度保守區(qū)設(shè)計(jì)，不會(huì)跟其他微生物的DNA發(fā)生交叉反應(yīng)。
■ 既可用于定性檢測(cè)，又可用于定量檢測(cè)。用于定量檢測(cè)時(shí)線性范圍至少為5個(gè)數(shù)量級(jí)。
■ 本產(chǎn)品足夠50次20μL體系的探針法熒光定量PCR反應(yīng)。
■ 本產(chǎn)品只能用于科研。

格及成分

成分	編號(hào)
A	190303
B	180701
C	100935
D	15-75430yp
E	75430pc
使用手冊(cè)	15-75430sc

運(yùn)輸及保存
低溫運(yùn)輸，-20℃保存，保存期限為12個(gè)月。

自備試劑
樣品DNA。

使用方法
一、稀釋標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品（以10E1-10E6拷貝/μL這6個(gè)10倍稀釋度為例）。由于標(biāo)準(zhǔn)品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨(dú)立的區(qū)域進(jìn)行，千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴(kuò)散傳染性病原，本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽性對(duì)照，只提供無傳染性的DNA片段作為陽性對(duì)照。
■ 標(biāo)記6個(gè)離心管，分別為6，5，4，3，2，1。
■ 用帶芯槍頭分別加入45 μL熒光PCR專用模板稀釋液，最好用帶芯槍頭，下同。
■ 在6號(hào)管中加入5 μL 1×10E7拷貝/μL 的陽性對(duì)照(試劑盒提供)，充分震蕩1分鐘，得1×10E6拷貝/μL的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。
■ 換槍頭，在5號(hào)管中加入5 μL 1×10E6拷貝/μL 的陽性對(duì)照(上步稀釋所得)，充分震蕩1分鐘，得1×10E5拷貝/μL的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。
■ 換槍頭，在4號(hào)管中加入5 μL 1×10E5拷貝/μL 的陽性對(duì)照(上步稀釋所得)，充分震蕩1分鐘，得1×10E4拷貝/μL的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。
■ 重復(fù)上面的操作直到得到6個(gè)稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。

二、樣品DNA的制備
■ 如果有N個(gè)樣品待提取，最好設(shè)置N+2個(gè)提取，多出的是PC（樣品制備陽性對(duì)照）和NC（樣品制備陰性對(duì)照）。可以取陽性對(duì)照的1000倍稀釋液10μL再加上一定量的水，使總體積與待提取樣品的規(guī)定體積一致，以此作為PC。另外用水作為NC。
■ 用自選方法純化樣品的DNA，本試劑盒跟市場(chǎng)上大多數(shù)DNA提取試劑盒兼容。

三、Probe qPCR反應(yīng)（20μL體系，在樣品制備室進(jìn)行）
■ 如果做定量分析并且只做1次重復(fù)，則標(biāo)記N+9個(gè)PCR管，其中N+2個(gè)用于上步得到的N+2個(gè)樣品，1個(gè)用于PCR陰性對(duì)照（用水做模板），6個(gè)用于標(biāo)準(zhǔn)曲線。如果做定性分析，并且只做1次重復(fù)，則標(biāo)記N+4個(gè)PCR管，其中N+2個(gè)用于上步得到的N+2個(gè)樣品，1個(gè)用于PCR陰性對(duì)照（用水做模板），1個(gè)用于PCR陽性對(duì)照（用第4號(hào)管的陽性對(duì)照稀釋液做模板）。下面只以定量分析為例描述操作步驟。
■ 在標(biāo)記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復(fù)。樣品管和陰性對(duì)照設(shè)置完畢后才設(shè)置陽性對(duì)照，并且陽性對(duì)照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲(chǔ)存好后最后加）：

成分/每管	樣品管 N+2個(gè)	PCR陰性對(duì)照管	標(biāo)準(zhǔn)曲線 樣品管（1-6管）
A	10 μL	10 μL	10 μL
D	3 μL	3 μL	3 μL
N+2個(gè)待測(cè)DNA模板	7 μL	-	-
C	-	7 μL	-
第6步所得標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品稀釋液（1-6號(hào)）	-	-	7 μL（1號(hào)樣到1號(hào)管，2號(hào)樣到2號(hào)管…）

■ 蓋上蓋子后上機(jī)，按下面參數(shù)進(jìn)行PCR：

過程	溫度	時(shí)間
預(yù)變性	95℃	10 min
PCR反應(yīng) （45個(gè)循環(huán)）	95℃	15 sec
	60℃	60 sec（采集FAM通道的熒光信號(hào)）

四、數(shù)據(jù)處理
■ 如果把本試劑盒用于定量檢測(cè)，則以陽性對(duì)照濃度的log值為橫軸，以Ct值為縱軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。再以待測(cè)樣品的Ct值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上推算出樣品核酸濃度的log值，再推算出其濃度。
■ 如果把本試劑盒用于定性檢測(cè)，只判斷陽性或陰性，則陰性對(duì)照Ct必須大于或等于40。陽性對(duì)照必須有熒光對(duì)數(shù)增長(zhǎng)，有典型擴(kuò)增曲線，Ct值應(yīng)該小于或等于39。對(duì)待測(cè)樣品，如果其Ct大于或等于40則為陰性，如果小于或等于39則為陽性。如果在39-40之間，則重復(fù)一次。重復(fù)實(shí)驗(yàn)的Ct值如果大于或等于40則為陰性，如果小于40，則為陽性。