海藻糖對(duì)纖維素蛋白酶的保護(hù)機(jī)理研究
海藻糖是一類新興的蛋白保護(hù)劑，可有效保護(hù)蛋白酶在不同條件下的活性，具體保護(hù)機(jī)制已有相關(guān)研究分析，本篇文章向大家介紹清華大學(xué)楊小民等的研究成果。
該研究通過測(cè)量海藻糖、葡萄糖、蔗糖、葡聚糖以及纖維素酶與這些糖的混合物的紅外光譜和差示掃描量熱譜圖，比較糖和纖維素酶分子之間的相互作用，以深入研究海藻糖對(duì)纖維素酶的保護(hù)機(jī)理。
通過比較糖和纖維素酶及其混合物的紅外（IR）譜圖，判斷海藻糖、葡萄糖和蔗糖原有氫鍵的作用形式發(fā)生了改變，纖維素酶和糖分子之間形成了氫鍵。而纖維素酶對(duì)葡聚糖的紅外光譜特征頻率幾乎沒有影響，說明酶和葡聚糖分子之間沒有明顯的相互作用。此外，紅外譜圖還表明，海藻糖、葡萄糖和蔗糖的羥基與纖維素酶分子的酰胺基之間存在比較強(qiáng)的分子間作用力。
根據(jù)差示掃描量熱譜圖結(jié)果，測(cè)得海藻糖玻璃化轉(zhuǎn)變溫度為107℃，相轉(zhuǎn)變溫度為123℃，葡聚糖玻璃化轉(zhuǎn)變溫度為92℃，相轉(zhuǎn)變溫度為132℃。葡萄糖和蔗糖沒有玻璃化轉(zhuǎn)變現(xiàn)象。說明海藻糖和葡聚糖都存在玻璃化轉(zhuǎn)變溫度且溫度較高，其在比較高的溫度下仍可處于玻璃態(tài)。
差示掃描量熱譜圖顯示，纖維素酶的物理熱變性溫度為120℃，在添加海藻糖之后，物理熱變性溫度提高到137℃，添加葡萄糖后該物理熱變性溫度提高到140℃，說明海藻糖和葡萄糖同纖維素酶的分子之間存在較強(qiáng)的分子間作用力，且該作用力增加了酶分子空間結(jié)構(gòu)的熱穩(wěn)定性。
綜合以上結(jié)果，葡萄糖和蔗糖在高溫下，其羥基可以替代水分子同纖維素酶分子表面的酰胺基形成氫鍵，但實(shí)驗(yàn)觀察發(fā)現(xiàn)，高溫下葡萄糖和蔗糖與酶的混合物發(fā)生明顯的褐變現(xiàn)象，說明有化學(xué)反應(yīng)發(fā)生，差示掃描也說明葡萄糖和蔗糖在高溫下不能形成玻璃態(tài)，因此高溫下葡萄糖與蔗糖無法保護(hù)纖維素酶的酶活性。
葡聚糖的羥基不能與纖維素酶分子形成氫鍵，但在高溫下能形成玻璃態(tài)對(duì)酶分子進(jìn)行保護(hù)。
海藻糖的羥基與纖維素酶的酰胺基以氫鍵形式結(jié)合，提高了酶的熱變性溫度。海藻糖分子包裹在酶分子周圍或填充在酶蛋白分子空間結(jié)構(gòu)內(nèi)，特別是酶活性部位附近，并在酶分子內(nèi)外部形成玻璃態(tài)，將酶蛋白的空間結(jié)構(gòu)固定住，從而保護(hù)酶活性。相比之下，海藻糖在上述四種糖類中能夠?yàn)槔w維素蛋白酶提供最強(qiáng)的保護(hù)作用。
該研究通過測(cè)量海藻糖、葡萄糖、蔗糖、葡聚糖以及纖維素酶與這些糖的混合物的紅外光譜和差示掃描量熱譜圖，比較糖和纖維素酶分子之間的相互作用，以深入研究海藻糖對(duì)纖維素酶的保護(hù)機(jī)理。
通過比較糖和纖維素酶及其混合物的紅外（IR）譜圖，判斷海藻糖、葡萄糖和蔗糖原有氫鍵的作用形式發(fā)生了改變，纖維素酶和糖分子之間形成了氫鍵。而纖維素酶對(duì)葡聚糖的紅外光譜特征頻率幾乎沒有影響，說明酶和葡聚糖分子之間沒有明顯的相互作用。此外，紅外譜圖還表明，海藻糖、葡萄糖和蔗糖的羥基與纖維素酶分子的酰胺基之間存在比較強(qiáng)的分子間作用力。
根據(jù)差示掃描量熱譜圖結(jié)果，測(cè)得海藻糖玻璃化轉(zhuǎn)變溫度為107℃，相轉(zhuǎn)變溫度為123℃，葡聚糖玻璃化轉(zhuǎn)變溫度為92℃，相轉(zhuǎn)變溫度為132℃。葡萄糖和蔗糖沒有玻璃化轉(zhuǎn)變現(xiàn)象。說明海藻糖和葡聚糖都存在玻璃化轉(zhuǎn)變溫度且溫度較高，其在比較高的溫度下仍可處于玻璃態(tài)。
圖1 海藻糖、葡聚糖、葡萄糖和蔗糖的差示掃描量熱譜圖
差示掃描量熱譜圖顯示，纖維素酶的物理熱變性溫度為120℃，在添加海藻糖之后，物理熱變性溫度提高到137℃，添加葡萄糖后該物理熱變性溫度提高到140℃，說明海藻糖和葡萄糖同纖維素酶的分子之間存在較強(qiáng)的分子間作用力，且該作用力增加了酶分子空間結(jié)構(gòu)的熱穩(wěn)定性。
圖2 纖維素酶與糖混合物的差示掃描量熱譜圖
綜合以上結(jié)果，葡萄糖和蔗糖在高溫下，其羥基可以替代水分子同纖維素酶分子表面的酰胺基形成氫鍵，但實(shí)驗(yàn)觀察發(fā)現(xiàn)，高溫下葡萄糖和蔗糖與酶的混合物發(fā)生明顯的褐變現(xiàn)象，說明有化學(xué)反應(yīng)發(fā)生，差示掃描也說明葡萄糖和蔗糖在高溫下不能形成玻璃態(tài)，因此高溫下葡萄糖與蔗糖無法保護(hù)纖維素酶的酶活性。
葡聚糖的羥基不能與纖維素酶分子形成氫鍵，但在高溫下能形成玻璃態(tài)對(duì)酶分子進(jìn)行保護(hù)。
海藻糖的羥基與纖維素酶的酰胺基以氫鍵形式結(jié)合，提高了酶的熱變性溫度。海藻糖分子包裹在酶分子周圍或填充在酶蛋白分子空間結(jié)構(gòu)內(nèi)，特別是酶活性部位附近，并在酶分子內(nèi)外部形成玻璃態(tài)，將酶蛋白的空間結(jié)構(gòu)固定住，從而保護(hù)酶活性。相比之下，海藻糖在上述四種糖類中能夠?yàn)槔w維素蛋白酶提供最強(qiáng)的保護(hù)作用。
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