Science揭示巨噬細胞kupffer的新幫手，原來竟是他？！​

2023年的國自然熱點，巨噬細胞憑借822個中標量榮登榜首，近三年的熱度也持續(xù)攀升。命運圖譜模型（fate-mapping）、轉(zhuǎn)錄組學等技術(shù)的不斷進步推動了揭開組織駐留巨噬細胞神秘面紗的腳步。今年6月，F(xiàn)rederic Geissmann團隊在nature發(fā)表了名為《Physiology and diseases of tissue-resident macrophages》，針對這些年組織駐留巨噬細胞的起源以及在不同組織或者生理過程中發(fā)揮的功能進行總結(jié)（感興趣的伙伴可以點擊標題閱讀原文）。九月，Paul Kubes團隊找到了肝纖維化病理狀態(tài)下組織駐留巨噬細胞的新幫手及其具體機制，巨噬細胞的研究進展如此可喜，快來和小優(yōu)一起看看吧！  

Kupffer細胞樣合胞體代償纖維化肝臟中常駐巨噬細胞的功能

文章概覽：
肝臟中的常駐巨噬細胞在與肝細胞、內(nèi)皮細胞和星狀細胞組成的龕位中接受指令，進而激活特定的轉(zhuǎn)錄因子，賦予其新身份：Kupffer細胞（KC）。在血竇中，KC向?qū)嵸|(zhì)細胞延伸偽足以保持其特性，充當人體的中央細菌過濾器，并且通過補體受體CRlg在內(nèi)的特異性受體，發(fā)揮從血液中捕捉病原體的功能。肝纖維化和肝硬化的發(fā)展過程十分相似，均會涉及肝細胞死亡和肝竇周圍的膠原沉積導致血流重新分配到新的和擴張的肝內(nèi)和肝外側(cè)支血管。然而在這種組織重塑過程中，KC如何適應變化尚未可知。

在這項研究中，作者觀察、追蹤并功能性評估了肝纖維化狀態(tài)中的單核細胞和KC：在纖維化龕中失去與實質(zhì)細胞的接觸會導致竇狀駐留的KC失去特性和功能，而單核細胞會跟隨側(cè)支血管的形成繞過竇，在竇中形成類似KC的合胞體，表達KC細胞標記，具有更強的捕捉細菌的能力，從而挽救并適應肝纖維化狀態(tài)中下調(diào)的KC細胞的功能特性（圖1）。這些細胞結(jié)構(gòu)可能在進化過程中發(fā)揮了關(guān)鍵作用，使哺乳動物能夠承受肝臟中嚴重的慢性損傷。這項研究成果有望改進肝纖維化患者的治療方案。 
 

圖1 肝纖維化中KC的適應變化
 

主要結(jié)果：
01 Kupffer細胞的免疫監(jiān)視功能及肝纖維化的進行性血管重塑
與其他免疫細胞不同的是，KC向?qū)嵸|(zhì)細胞（肝星狀細胞、肝竇內(nèi)皮細胞、肝細胞）延伸偽足，形成KC龕（圖2A-B），兩者之間的相互作用對于維持KC細胞的功能十分重要，這種生態(tài)位也是免疫監(jiān)視的最佳選擇，如小鼠感染葡萄球菌（MW2-GFP）后，KC能夠迅速捕獲細菌，并且為了KC能夠迅速占據(jù)大量竇腔，竇道會變得足夠狹窄（圖2C）。

圖2 Kupffer細胞的免疫監(jiān)視功能及肝纖維化的進行性血管重塑 
 

02 肝纖維化改變了Kupffer細胞的生態(tài)位，導致其功能喪失
明確了KC的免疫監(jiān)視功能之后，作者接下來研究了在肝纖維化病理狀態(tài)下的KC生態(tài)位。與正常小鼠相比，CCl4建立的小鼠肝纖維化模型中，肝竇周圍有大量的膠原沉積，肝血流量也降低（圖3A-D），并且肝竇的直徑減小，KC的偽足也明顯減少（圖3E-F），不僅如此，與健康受試者相比，肝硬化（F4期纖維化）患者的KC平均數(shù)也降低（圖3G-H）。進一步地，作者證實了KC與造血干細胞之間的共定位（圖3I）。感染金黃色葡萄球菌后，與對照組小鼠相比，肝纖維化小鼠肝竇中KC的細菌捕獲明顯減少，在捕獲細菌的竇液中，F(xiàn)4/80+巨噬細胞的比例也有所下降，同時血液及脾臟中的細菌負荷也明顯高于對照組（圖3J-L）。由于KC也能夠殺死捕獲的葡萄球菌，接下來作者對兩組小鼠KC的吞噬能力進行測定，與對照組相比，CCl4處理后，對捕獲異物的酸化處理延遲了一個小時（圖3M），這表明，肝纖維化環(huán)境中KC的抗菌能力下調(diào)甚至喪失。 

圖3 肝纖維化改變了Kupffer細胞的生態(tài)位，導致其功能喪失 
 

03 肝纖維化導致Kupffer細胞特性喪失
由于纖維化肝竇中巨噬細胞喪失KC特性，作者接下來重點研究了賦予KC表型適應性的兩個關(guān)鍵分子：免疫球蛋白超家族互補受體（CRIg）和T細胞膜蛋白4（TIM-4）。與對照組小鼠相比，CCl4處理后，表達TIM-4和/或CRIg的F4/80+巨噬細胞明顯減少，并且四種KC識別標記物（CLEC2、CLEC4F、CRIg和TIM-4）的水平也顯著降低（圖4A-D）。在肝硬化患者的活檢組織中也觀察到了，IBA1+（IBA1可識別所有巨噬細胞）人肝竇巨噬細胞中CRIg的丟失（圖4L-M）。為了研究肝竇KC的發(fā)育，作者使用了Ms4a3cre×Rosatdtomato單核細胞命運圖譜小鼠，其骨髓（BM）衍生的前體而非胎肝衍生的常駐巨噬細胞會發(fā)出熒光。穩(wěn)態(tài)條件下，肝竇中2-10%巨噬細胞來自BM來源的單核細胞。經(jīng)過8周的CCl4處理后，竇腔中約30%的巨噬細胞來自BM來源的單核細胞，70%來自胎肝來源的KC，（圖4E-F）。將來源于BM的Ms4a3+F4/80+細胞和來源于胎肝的Ms4a3-F4/80+細胞分類為表達CRIg和TIM4的細胞，結(jié)果顯示這些標記在胎肝細胞和來源于BM的細胞中的比例相似，這表明KC在纖維化過程中正在發(fā)生去分化（圖4G）。
此外，F(xiàn)4/80+CRIg+TIM-4+細胞的Ms4a3比例最低，但F4/80+CRIg+TIM-4-細胞和F4/80+CRIg-TIM-4-細胞的單核細胞替代率低于50%（圖4H）。8周的CCl4處理后，宿主CK也降低了10%左右（圖4I）。Clec4fcre-nTdTomato×Rosa26ZsGreen小鼠中，竇道中超過95%的F4/80+細胞共表達了tdTomato和ZsGreen，表明KC表型活躍，然而CCl4處理后，肝竇中存在三種F4/80+細胞亞群：tdTomato+ZsGreen+KCs、tdTomato-ZsGreen+前KCs（exKCs）和無CLEC4F表達的F4/80+細胞（圖4J）。這表明KC細胞下調(diào)的標記物，除了CRIg和TIM4，還有CLEC4F。并且，CCl4處理后ZsGreen+tdTomato+F4/80+KC的細菌捕獲能力更強（圖3K）。這表明，即使在纖維化過程中，也需要KC表型來捕獲細菌。

圖4 肝纖維化導致Kupffer細胞特性喪失
 

04 纖維化中出現(xiàn)多核合胞體，Kupffer細胞特征增強
既然在纖維化過程中，也需要KC表型來捕獲細菌，而事實情況也是大多數(shù)細菌仍能夠在肝纖維化過程中被有效捕獲（圖3K），那么肝臟的適應變化是什么樣的呢？作者發(fā)現(xiàn)，CCl4處理后，感染葡萄球菌的小鼠存活率僅有微小差異，然而消耗小鼠的巨噬細胞或者KC后感染細菌將導致100%或80%的死亡率（圖5A-B）。更有意思的是，CCl4處理后，在側(cè)支血管形成了大量的F4/80+巨噬細胞聚集，偶爾能看到單個巨噬細胞（圖5C），這些巨噬細胞集落平均捕獲的葡萄球菌在30個左右，并且都表達高水平的CRIg（圖5D）。與野生型小鼠相比，CRIg-/-小鼠在CCl4處理8周后也會形成巨噬細胞聚集，但無法捕獲細菌（圖5G），并且在靜脈注射金黃色葡萄球菌MW2后，小鼠肝臟中的菌血癥增加，肝臟CFU（colony-forming units）減少（圖5H）。側(cè)支血管中的巨噬細胞集落也能夠迅速酸化葡萄球菌生物顆粒，其動力學與KC相似，巨噬細胞集落從高流量血管中高效清除細菌的能力因肝臟血流的機械性減少而急劇下降，并在血流恢復正常后迅速恢復（圖5I-J）。因此，表達CRIg的巨噬細胞集落的出現(xiàn)將纖維化肝臟的捕獲能力從肝竇轉(zhuǎn)移到了側(cè)支靜脈。
高分辨率顯微鏡（圖5K）和透射電子顯微鏡（TEM）（圖5L）顯示在小鼠纖維化肝臟中發(fā)現(xiàn)了多核巨型巨噬細胞，表明在某些情況下這些細胞會融合成巨型細胞，作者將這些命名為“Kupffer細胞樣合胞體”。不僅如此，作者在不同病因的肝硬化患者組織中發(fā)現(xiàn)了大量的CD68+多核巨細胞集落，這些KC樣合胞體也呈CRIg陽性（圖5M-O）。 

圖5 纖維化中出現(xiàn)多核合胞體，Kupffer細胞特征增強

05 合胞體具有Kupffer細胞表型，并且來源于骨髓
合胞體除了具有超強的細菌捕獲能力、高度表達CRIg之外，還表達TIM-4和CLEC4F，盡管具有KC表型，但約90%的合胞體表達Ms4a3，這也表明合胞體主要來源于單核細胞（圖6A-D）。CCl4處理2周時，表達CX3CR1的單核細胞在大血管內(nèi)廣泛募集，并開始表達F4/80，4周時達到巔峰，但在竇內(nèi)沒有募集，而缺乏CX3CR1的KC則位于周圍的竇道中，這表明，肝纖維化過程中招募的單核細胞而非更早時期是KC樣合胞體的來源。使用PKH標記常駐巨噬細胞，8周的CCl4處理后，竇狀KC可被標記，而合胞體不會，這說明竇狀KC不是合胞體的來源（圖6E-I）。

圖6 合胞體具有Kupffer細胞表型，并且來源于骨髓 
 

06 Kupffer細胞樣合胞體通過CD44和共生微生物被招募
細菌從腸道轉(zhuǎn)移是人類肝硬化的一個特征。相比較對照小鼠，從出生起就接受抗生素治療的小鼠或者無菌小鼠，在CCl4處理后，合胞體形成顯著減少（圖7A-B），此外，靜脈注射金黃色葡萄球菌也會減少兩種小鼠肝臟對細菌的捕獲，并增加血液中的細菌數(shù)量（圖7C-F），經(jīng)CCl4處理的Myd88-/-小鼠（對細菌感染的敏感性增加）也表現(xiàn)出較少的合胞體形成（圖7G）。合胞體從骨髓招募到側(cè)支血管的具體機制是怎樣的呢？作者通過分析最近發(fā)表的CCl4纖維化模型以及人類肝硬化中單核巨噬細胞的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)集，找到了在細胞融合與粘附過程中上調(diào)的一些關(guān)鍵基因：CD9、CD36和CD44，同時CD44是肝臟中多種類型細胞的主要粘附機制。CCl4處理后，CD44-/-小鼠側(cè)支血管中單核細胞數(shù)量顯著減少，8周后甚至沒有KC樣合胞體的形成。不僅如此，骨髓派生的CD44而非實質(zhì)細胞CD44是KC樣合胞體形成的必要條件（圖7I-L）。與野生型小鼠相比，經(jīng)CCl4處理后，CD44-/-小鼠肝臟的細菌捕獲能力明顯降低，纖維化肝臟中的CFU數(shù)量減少了三分之一，并且存活率也更低。獲得了骨髓派生的KC合胞體的小鼠表現(xiàn)出更強的細菌捕獲能力并減少了菌血癥（圖7M-Q）。更有意思的是，未被細菌感染的野生小鼠和CD44-/-均存活，也就意味著非病理狀態(tài)下，不涉及KC樣合胞體的形成（圖7Q）。這些結(jié)果證明了：Kupffer細胞樣合胞體從骨髓招募到側(cè)支血管依賴于CD44和共生微生物。
 

圖7 Kupffer細胞樣合胞體通過CD44和共生微生物被招募 

細胞融合與粘附過程中的關(guān)鍵基因除了CD44還有CD9和CD36，作者接下來研究了CD9和CD36是否參與其中�？笴D9阻斷抗體對CCl4處理后小鼠合胞體沒有影響，CD36-/-小鼠在CCl4處理后未能形成合胞體，但是側(cè)支血管中有大量CRIg+F4/80+細胞，這表明CD36-/-單核細胞被招募，但未能形成合胞體，而是以分散的單個巨噬細胞的形式出現(xiàn)，并且與KC樣合胞相比，單個巨噬細胞在絡(luò)脈中所占的體積要小得多（圖8A-C）。作者同樣也證明了只有骨髓派生的CD36才是KC樣合胞體形成的必要條件（圖8D）。經(jīng)CCl4處理的CD36-/-小鼠的巨噬細胞盡管高度表達CRIg，但是缺乏在較大血管中捕獲細菌的能力，小鼠的存活率也較低。同樣地，獲得了骨髓派生的KC合胞體的小鼠表現(xiàn)出更強的細菌捕獲能力以及清除能力（圖8E-I），這些結(jié)果也證實了Kupffer細胞樣合胞體的粘附和融合依賴于CD36。  

圖8 Kupffer細胞樣合胞體依賴于清道夫受體CD36進行細胞粘附和融合 
 

全文總結(jié)
作者的研究結(jié)果表明，KC在肝臟處于病理狀態(tài)下（如肝纖維化）由于自身生態(tài)位的改變，會失去巨噬細胞特性及其在肝竇內(nèi)捕捉細菌的功能。肝臟針對這種變化做出的適應性改變是：招募骨髓中的單核細胞到側(cè)支血管，賦予其KC功能，并且單核細胞聚集形成KC樣合胞體，具備更高的細菌捕獲及清除能力。具體機制是：肝臟中微生物或者微生物產(chǎn)物的增加以及血管中的高剪切力導致單核細胞被CD44募集，進而形成KC合胞體，同時依賴于CD36進行細胞粘附和融合。