PCR擴(kuò)增DNA的基本原理和幾個(gè)特點(diǎn)介紹
PCR擴(kuò)增DNA的原理：
先將含有所需擴(kuò)增分析序列的靶DNA雙鏈經(jīng)熱變性處理解開(kāi)為兩個(gè)寡聚核苷酸單鏈，然后加入一對(duì)根據(jù)已知DNA序列由人工合成的與所擴(kuò)增的DNA兩端鄰近序列互補(bǔ)的寡聚核苷酸片段作為引物，即左右引物。此引物范圍就在包括所欲擴(kuò)增的DNA片段，一般需20-30個(gè)堿基對(duì)，過(guò)少則難保持與DNA單鏈的結(jié)合。引物與互補(bǔ)DNA結(jié)合后，以靶DNA單鏈為模板，經(jīng)反鏈雜交復(fù)性（退火），在Taq DNA聚合酶的作用下以4種三磷酸脫氧核苷（dNTP）為原料按5'到3'方向?qū)⒁镅由�、自�?dòng)合成新的DNA鏈、使DNA重新復(fù)制成雙鏈。然后又開(kāi)始第二次循環(huán)擴(kuò)增。引物在反應(yīng)中不僅起引導(dǎo)作用，而且起著特異性的限制擴(kuò)增DNA片段范圍大小的作用。新合成的DNA鏈含有引物的互補(bǔ)序列，并又可作為下一輪聚合反應(yīng)的模板。如此重復(fù)上述DNA模板加熱變性雙鏈解開(kāi)—引物退火復(fù)性—在DNA聚合酶作用下的引物延伸的循環(huán)過(guò)程，使每次循環(huán)延伸的模板又增加1倍，亦即擴(kuò)增DNA產(chǎn)物增加1倍，經(jīng)反復(fù)循環(huán)，使靶DNA片段指數(shù)性擴(kuò)增。
PCR的擴(kuò)增倍數(shù)Y=（1+E）n,這里Y是擴(kuò)增量，n為PCR的循環(huán)次數(shù)。E為PCR循環(huán)擴(kuò)增效率。設(shè)PCR擴(kuò)增效率E為100%、循環(huán)次數(shù)n=25次，靶DNA將擴(kuò)增到33554432個(gè)拷貝，即擴(kuò)增3355萬(wàn)倍：若E為80%、n=20、則擴(kuò)增數(shù)量將下降到1408865拷貝，即擴(kuò)增產(chǎn)物約丟失93%，若E=100%，n=20，則擴(kuò)增數(shù)量減少1048576個(gè)拷貝，擴(kuò)增產(chǎn)物約減少97%。可見(jiàn)PCR循環(huán)擴(kuò)增效率及循環(huán)次數(shù)都對(duì)擴(kuò)增數(shù)量有很大影響。PCR擴(kuò)增屬于酶促反應(yīng)，所以，DNA擴(kuò)增過(guò)程遵循酶促動(dòng)力學(xué)原理。靶DNA片段的擴(kuò)增最初表現(xiàn)為直線上升，隨著靶DNA片段的逐漸積累，當(dāng)引物—模板/DNA/聚合酶達(dá)到一定比值時(shí)，酶的促化反應(yīng)趨于飽和，此時(shí)靶DNA產(chǎn)物的濃度不再增加，即出現(xiàn)所謂平臺(tái)效應(yīng)。PCR反應(yīng)達(dá)到平臺(tái)期的時(shí)間主要取決于反應(yīng)開(kāi)始時(shí)樣品中的靶DNA的含量和擴(kuò)增效率，起始模板量越多到達(dá)平臺(tái)期的時(shí)間就越短、擴(kuò)增效率越高到達(dá)平臺(tái)期的時(shí)間也越短。另外酶的含量，dNTp 濃度，非特異性產(chǎn)物的擴(kuò)增都對(duì)到達(dá)平臺(tái)期時(shí)間有影響。
PCR的特點(diǎn)：
一、特異性高
首次報(bào)導(dǎo)的PCR所用的DNA聚合酶是大腸桿菌的DNAPolymerase I的Klenow大片段，其酶活性在90℃會(huì)變性失活，需每次PCR循環(huán)都要重新加入Klenow大片段，同時(shí)引物是在37℃延伸（聚合）易產(chǎn)生模板—引物之間的堿基錯(cuò)配、致特異性較差，1988年Saiki等從溫泉水中分離到的水生嗜熱桿菌中提取的熱穩(wěn)定的Taq DNA聚合酶，在熱變性處理時(shí)不被滅活，不必在每次循環(huán)擴(kuò)增中再加入新酶，可以在較高溫度下連續(xù)反應(yīng)，顯著地提高PCR產(chǎn)物的特異性，序列分析證明其擴(kuò)增的DNA序列與原模板DNA一致。擴(kuò)增過(guò)程中，單核苷酸的錯(cuò)誤參入程度很低、其錯(cuò)配率一般只有約萬(wàn)分之一，足可以提供特異性分析，選用各型病毒相對(duì)的特異寡核苷酸引物。PCR能一次確定病毒的多重感染。如用HPV11和HPV16型病毒引物檢測(cè)病婦宮頸刮片細(xì)胞可以發(fā)現(xiàn)部分病人存在HPV11和HPV16兩型的雙重感染。
二、高度敏感
理論上PCR可以按2n倍數(shù)擴(kuò)增DNA十億倍以上，實(shí)際應(yīng)用已證實(shí)可以將極微量的靶DNA成百萬(wàn)倍以上地?cái)U(kuò)增到足夠檢測(cè)分析量的DNA。能從100萬(wàn)個(gè)細(xì)胞中檢出一個(gè)靶細(xì)胞，或?qū)χT如病人口液等只含一個(gè)感染細(xì)胞的標(biāo)本或僅含0.01pg的感染細(xì)胞的特異性片段樣品中均可檢測(cè)。
三、快速及無(wú)放射性
一般在2小時(shí)內(nèi)約可完成30次以上的循環(huán)擴(kuò)增，加上用電泳分析。只需3-4小時(shí)便可完成，不用分離提純病毒，DNA粗制品及總RNA均可作為反應(yīng)起始物，可直接用臨床標(biāo)本如血液、體液、尿液、洗液、脫落毛發(fā)、細(xì)胞、活體組織等粗制的DNA的提取液來(lái)擴(kuò)增檢測(cè)，省去費(fèi)時(shí)繁雜的提純程序，擴(kuò)增產(chǎn)物用一般電泳分析即可，不一定用同位素，無(wú)放射性易于推廣。
四、簡(jiǎn)便
擴(kuò)增產(chǎn)物可直接供作序列分析和分子克隆，擺脫繁瑣的基因方法，可直接從RNA或染色體DNA中或部分DNA已降解的樣品中分離目的基因，省去常規(guī)方法中須先進(jìn)行克隆后再作序列分析的冗繁程序。已固定的和包埋的組織或切片亦可檢測(cè)。如在PCR引物端事先構(gòu)建一個(gè)內(nèi)切酶位點(diǎn)，擴(kuò)增的靶DNA可直接克隆到M13，PUC19等相應(yīng)酶切位點(diǎn)的載體中。
五、可擴(kuò)增RNA或cDNA
先按通常方法用寡脫氧胸苷引物和逆轉(zhuǎn)錄酶將mRNA轉(zhuǎn)變成單鏈cDNA，再將得到的單鏈cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，即使mRNA轉(zhuǎn)錄片段只有100ngcDNA中的0.01%，也能經(jīng)PCR擴(kuò)增1ng有242堿基對(duì)長(zhǎng)度的特異片段，有些外顯子分散在一段很長(zhǎng)的DNA中，難以將整段DNA大分子擴(kuò)增和做序列分析。若以mRNA作模板，則可將外顯子集中，用PCR一次便完成對(duì)外顯子的擴(kuò)增并進(jìn)行序列分析。
先將含有所需擴(kuò)增分析序列的靶DNA雙鏈經(jīng)熱變性處理解開(kāi)為兩個(gè)寡聚核苷酸單鏈，然后加入一對(duì)根據(jù)已知DNA序列由人工合成的與所擴(kuò)增的DNA兩端鄰近序列互補(bǔ)的寡聚核苷酸片段作為引物，即左右引物。此引物范圍就在包括所欲擴(kuò)增的DNA片段，一般需20-30個(gè)堿基對(duì)，過(guò)少則難保持與DNA單鏈的結(jié)合。引物與互補(bǔ)DNA結(jié)合后，以靶DNA單鏈為模板，經(jīng)反鏈雜交復(fù)性（退火），在Taq DNA聚合酶的作用下以4種三磷酸脫氧核苷（dNTP）為原料按5'到3'方向?qū)⒁镅由�、自�?dòng)合成新的DNA鏈、使DNA重新復(fù)制成雙鏈。然后又開(kāi)始第二次循環(huán)擴(kuò)增。引物在反應(yīng)中不僅起引導(dǎo)作用，而且起著特異性的限制擴(kuò)增DNA片段范圍大小的作用。新合成的DNA鏈含有引物的互補(bǔ)序列，并又可作為下一輪聚合反應(yīng)的模板。如此重復(fù)上述DNA模板加熱變性雙鏈解開(kāi)—引物退火復(fù)性—在DNA聚合酶作用下的引物延伸的循環(huán)過(guò)程，使每次循環(huán)延伸的模板又增加1倍，亦即擴(kuò)增DNA產(chǎn)物增加1倍，經(jīng)反復(fù)循環(huán)，使靶DNA片段指數(shù)性擴(kuò)增。
PCR的擴(kuò)增倍數(shù)Y=（1+E）n,這里Y是擴(kuò)增量，n為PCR的循環(huán)次數(shù)。E為PCR循環(huán)擴(kuò)增效率。設(shè)PCR擴(kuò)增效率E為100%、循環(huán)次數(shù)n=25次，靶DNA將擴(kuò)增到33554432個(gè)拷貝，即擴(kuò)增3355萬(wàn)倍：若E為80%、n=20、則擴(kuò)增數(shù)量將下降到1408865拷貝，即擴(kuò)增產(chǎn)物約丟失93%，若E=100%，n=20，則擴(kuò)增數(shù)量減少1048576個(gè)拷貝，擴(kuò)增產(chǎn)物約減少97%。可見(jiàn)PCR循環(huán)擴(kuò)增效率及循環(huán)次數(shù)都對(duì)擴(kuò)增數(shù)量有很大影響。PCR擴(kuò)增屬于酶促反應(yīng)，所以，DNA擴(kuò)增過(guò)程遵循酶促動(dòng)力學(xué)原理。靶DNA片段的擴(kuò)增最初表現(xiàn)為直線上升，隨著靶DNA片段的逐漸積累，當(dāng)引物—模板/DNA/聚合酶達(dá)到一定比值時(shí)，酶的促化反應(yīng)趨于飽和，此時(shí)靶DNA產(chǎn)物的濃度不再增加，即出現(xiàn)所謂平臺(tái)效應(yīng)。PCR反應(yīng)達(dá)到平臺(tái)期的時(shí)間主要取決于反應(yīng)開(kāi)始時(shí)樣品中的靶DNA的含量和擴(kuò)增效率，起始模板量越多到達(dá)平臺(tái)期的時(shí)間就越短、擴(kuò)增效率越高到達(dá)平臺(tái)期的時(shí)間也越短。另外酶的含量，dNTp 濃度，非特異性產(chǎn)物的擴(kuò)增都對(duì)到達(dá)平臺(tái)期時(shí)間有影響。
PCR的特點(diǎn)：
一、特異性高
首次報(bào)導(dǎo)的PCR所用的DNA聚合酶是大腸桿菌的DNAPolymerase I的Klenow大片段，其酶活性在90℃會(huì)變性失活，需每次PCR循環(huán)都要重新加入Klenow大片段，同時(shí)引物是在37℃延伸（聚合）易產(chǎn)生模板—引物之間的堿基錯(cuò)配、致特異性較差，1988年Saiki等從溫泉水中分離到的水生嗜熱桿菌中提取的熱穩(wěn)定的Taq DNA聚合酶，在熱變性處理時(shí)不被滅活，不必在每次循環(huán)擴(kuò)增中再加入新酶，可以在較高溫度下連續(xù)反應(yīng)，顯著地提高PCR產(chǎn)物的特異性，序列分析證明其擴(kuò)增的DNA序列與原模板DNA一致。擴(kuò)增過(guò)程中，單核苷酸的錯(cuò)誤參入程度很低、其錯(cuò)配率一般只有約萬(wàn)分之一，足可以提供特異性分析，選用各型病毒相對(duì)的特異寡核苷酸引物。PCR能一次確定病毒的多重感染。如用HPV11和HPV16型病毒引物檢測(cè)病婦宮頸刮片細(xì)胞可以發(fā)現(xiàn)部分病人存在HPV11和HPV16兩型的雙重感染。
二、高度敏感
理論上PCR可以按2n倍數(shù)擴(kuò)增DNA十億倍以上，實(shí)際應(yīng)用已證實(shí)可以將極微量的靶DNA成百萬(wàn)倍以上地?cái)U(kuò)增到足夠檢測(cè)分析量的DNA。能從100萬(wàn)個(gè)細(xì)胞中檢出一個(gè)靶細(xì)胞，或?qū)χT如病人口液等只含一個(gè)感染細(xì)胞的標(biāo)本或僅含0.01pg的感染細(xì)胞的特異性片段樣品中均可檢測(cè)。
三、快速及無(wú)放射性
一般在2小時(shí)內(nèi)約可完成30次以上的循環(huán)擴(kuò)增，加上用電泳分析。只需3-4小時(shí)便可完成，不用分離提純病毒，DNA粗制品及總RNA均可作為反應(yīng)起始物，可直接用臨床標(biāo)本如血液、體液、尿液、洗液、脫落毛發(fā)、細(xì)胞、活體組織等粗制的DNA的提取液來(lái)擴(kuò)增檢測(cè)，省去費(fèi)時(shí)繁雜的提純程序，擴(kuò)增產(chǎn)物用一般電泳分析即可，不一定用同位素，無(wú)放射性易于推廣。
四、簡(jiǎn)便
擴(kuò)增產(chǎn)物可直接供作序列分析和分子克隆，擺脫繁瑣的基因方法，可直接從RNA或染色體DNA中或部分DNA已降解的樣品中分離目的基因，省去常規(guī)方法中須先進(jìn)行克隆后再作序列分析的冗繁程序。已固定的和包埋的組織或切片亦可檢測(cè)。如在PCR引物端事先構(gòu)建一個(gè)內(nèi)切酶位點(diǎn)，擴(kuò)增的靶DNA可直接克隆到M13，PUC19等相應(yīng)酶切位點(diǎn)的載體中。
五、可擴(kuò)增RNA或cDNA
先按通常方法用寡脫氧胸苷引物和逆轉(zhuǎn)錄酶將mRNA轉(zhuǎn)變成單鏈cDNA，再將得到的單鏈cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，即使mRNA轉(zhuǎn)錄片段只有100ngcDNA中的0.01%，也能經(jīng)PCR擴(kuò)增1ng有242堿基對(duì)長(zhǎng)度的特異片段，有些外顯子分散在一段很長(zhǎng)的DNA中，難以將整段DNA大分子擴(kuò)增和做序列分析。若以mRNA作模板，則可將外顯子集中，用PCR一次便完成對(duì)外顯子的擴(kuò)增并進(jìn)行序列分析。
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