關(guān)于細(xì)胞培養(yǎng)中的“無菌技術(shù)”

關(guān)于細(xì)胞房管理制度的建議：

 

● 所有使用人員要嚴(yán)格按照無菌標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行操作，保持實(shí)驗(yàn)室清潔。

● 初次進(jìn)入細(xì)胞房的人員，不可獨(dú)立使用細(xì)胞房。

● 所有使用人員不得在細(xì)胞房內(nèi)開展與細(xì)胞培養(yǎng)無關(guān)的實(shí)驗(yàn)。

● 嚴(yán)禁將可能含有污染物或病原菌的實(shí)驗(yàn)物品帶入實(shí)驗(yàn)室。

● 定期進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室清潔，所有使用人員積極做好日常維護(hù)工作。

 

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無菌 VS 消毒

無菌：

是滅菌的結(jié)果，指用物理或化學(xué)方法使存在于產(chǎn)品中的所有微生物（包括最耐熱的細(xì)菌芽孢）失去活性，使它不能有生存和繁殖的機(jī)會(huì)（絕對(duì)無菌）。

消毒：

殺滅或清除傳播媒介上病原微生物，使其達(dá)到無害化的處理（不一定殺滅芽孢）。

 

無菌技術(shù)：

是指在醫(yī)療、護(hù)理操作中，防止一切微生物侵入人體和防止無菌物品、無菌區(qū)域被污染的操作技術(shù)。

 

目的：

• 防止一切微生物侵入機(jī)體。

• 保持無菌物品及無菌區(qū)域不被污染。

• 使已使用的無菌物品保持無菌狀態(tài)和有效時(shí)間。

 

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細(xì)胞房區(qū)域的無菌介紹
 

常規(guī)細(xì)胞房的構(gòu)造含有無菌操作區(qū)、孵育區(qū)、制備區(qū)、清洗消毒滅菌區(qū)和儲(chǔ)藏區(qū)。

 

1、無菌操作區(qū)：只限于細(xì)胞培養(yǎng)及其他無菌操作，最好能與外界隔離，不能受到穿行或受其他干擾。一般由更衣間、緩沖間和操作間三部分組成。

更衣間：用于更換實(shí)驗(yàn)服，鞋子及穿戴帽子、口罩、手套。

緩沖間：位于更衣間與操作間之間。目的是為了保證操作間的無菌環(huán)境，同時(shí)可放置細(xì)胞培養(yǎng)箱及某些必需的小型儀器。

無菌操作間：專用于無菌操作、細(xì)胞培養(yǎng)。

2、孵育區(qū)：孵育區(qū)對(duì)無菌的要求較低點(diǎn)，但仍需要保持清潔無塵。減少外界干擾和穿行的區(qū)域。

3、試劑準(zhǔn)備區(qū)：主要進(jìn)行培養(yǎng)液及有關(guān)培養(yǎng)用的液體制備。

4、清洗消毒滅菌區(qū)：主要進(jìn)行所有細(xì)胞培養(yǎng)過程使用的器具清洗、準(zhǔn)備、消毒及三蒸水制備等工作。

5、儲(chǔ)藏區(qū)：主要存放各類冰箱、干燥箱、液氮罐、無菌培養(yǎng)液、培養(yǎng)瓶等設(shè)備。此環(huán)境需要清潔無塵。

 

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實(shí)驗(yàn)室常見的滅菌方法
 

根據(jù)滅菌對(duì)象不同，滅菌的方法不同

1、高壓蒸汽滅菌

● 適用于藥品、容器、培養(yǎng)基（細(xì)菌類）、無菌衣及其他遇高溫和潮濕不發(fā)生變化或損壞的物品。

● 過程：100kpa 121℃ 20min。

● 利用高壓蒸汽以及在蒸汽環(huán)境中存在的潛熱作用和良好的穿透力，使菌體蛋白質(zhì)凝固變性而使微生物死亡。

缺點(diǎn)：如對(duì)培養(yǎng)基或液體溶液滅菌，滅菌的時(shí)間與樣本體積有關(guān)，時(shí)間不足達(dá)不到滅菌效果，時(shí)間過長會(huì)影響樣本內(nèi)的物質(zhì)活性。

2、干熱滅菌

● 適用于耐高溫、干燥的物品，玻璃器皿和金屬用具等。

● 過程：120-150℃，90-120min，殺死細(xì)菌和芽孢。

● 主要適用于不便在高壓蒸汽滅菌器中滅菌，且不易被高溫?fù)p壞的玻璃器皿、金屬器械以及不能和蒸汽接觸的物品的滅菌。

缺點(diǎn)：適用性不強(qiáng)。

3、射線滅菌法

● 適合于實(shí)驗(yàn)室空氣、地面、操作臺(tái)面滅菌。

● 利用紫外線燈進(jìn)行照射滅菌方法。紫外線是一種低能量的電磁輻射，可以殺滅多種微生物。紫外線的作用機(jī)制就是通過對(duì)微生物的核酸及蛋白質(zhì)等的破壞作用而使其滅活。

缺點(diǎn)：紫外線殺菌效果一般，對(duì)培養(yǎng)物和一些試劑會(huì)產(chǎn)生不良影響。

4、過濾除菌法

● 適用于血清、細(xì)胞培養(yǎng)基等熱不穩(wěn)定的生物制品及空氣的除菌。

● 將液體或氣體通過有微孔的濾膜過濾，使大于濾膜孔徑的細(xì)菌等微生物顆粒阻留，從而達(dá)到除菌的方法。

缺點(diǎn)：過濾法除菌大多用于遇熱易發(fā)生分解、變性而失效的試劑、酶液、血清、培養(yǎng)液等。

5、化學(xué)滅菌法

指用化學(xué)藥品來殺滅微生物的方法。同一種化學(xué)藥品的低濃度時(shí)呈現(xiàn)抑菌作用，而在高濃度時(shí)則能起殺菌作用。

殺菌機(jī)理：能使微生物蛋白質(zhì)變性死亡，或與酶系統(tǒng)結(jié)合影響代謝，或改變膜壁通透性使微生物死亡等。

● 消毒劑消毒法

消毒是指殺死病原微生物的方法。但化學(xué)消毒劑大多僅能殺死微生物的繁殖體而不能殺死芽孢，能控制一定范圍的無菌狀態(tài)。常用于物體表面滅菌，但要注意消毒液濃度不宜過高，以防止化學(xué)腐蝕作用。

● 化學(xué)氣體滅菌法

指利用化學(xué)藥品的氣體或產(chǎn)生的蒸汽進(jìn)行殺滅微生物的方法。

環(huán)氧乙烷滅菌法：傳統(tǒng)的滅菌法，可應(yīng)用于工衣滅菌，不耐加熱滅菌的藥品、醫(yī)用器具、設(shè)施、設(shè)備等滅菌。重要影響因素：溫度、濕度、氣體濃度、滅菌時(shí)間。

● 甲醛等蒸汽熏蒸法

采用甲醛、丙二醇或過氧醋酸等化學(xué)品，通過加熱產(chǎn)生蒸汽進(jìn)行空氣環(huán)境滅菌。

● 臭氧消毒法

臭氧在常溫、常壓下分子結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，很快自行分解成氧分子和單個(gè)氧原子，后者具有很強(qiáng)的活性，對(duì)細(xì)胞有極強(qiáng)的氧化作用，臭氧氧化分解了細(xì)菌內(nèi)部氧化葡萄糖所必須的酶，從而破壞其細(xì)胞膜，將其殺死，多余的氧原子則會(huì)自行重新結(jié)合成為普通氧分子，不存在任何有害殘留物，故稱為無污染消毒劑。

 

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超凈工作臺(tái)/生物安全柜使用注意事項(xiàng)

 

*所有使用人員在開始實(shí)驗(yàn)前，請(qǐng)用紫外線燈正確照射30min。工作臺(tái)面上的操作均要保證無菌。

 

● 開啟后，請(qǐng)用酒精棉球擦拭工作區(qū)域，或者噴灑酒精后用無塵紙擦拭，所有放入超凈臺(tái)或生物安全柜的物品均需要消毒擦拭。

● 準(zhǔn)確設(shè)置操作臺(tái)面的不同區(qū)域，有序開展實(shí)驗(yàn)操作。

● 操作結(jié)束，及時(shí)清理個(gè)人物品，清潔工作臺(tái)面，開啟紫外線燈消毒。

右手操作習(xí)慣的區(qū)域設(shè)置（圖源網(wǎng)絡(luò)，侵權(quán)必刪，僅供參考）

 

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顯微鏡使用注意事項(xiàng)

*常規(guī)顯微鏡使用前后可使用酒精棉球擦拭載物臺(tái)。載物臺(tái)如有污染物，需要仔細(xì)清潔后再使用。

● 使用完畢，請(qǐng)及時(shí)關(guān)閉燈光與電源。必要時(shí)請(qǐng)?zhí)咨戏缐m罩。

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細(xì)胞培養(yǎng)箱使用注意事項(xiàng)

*細(xì)胞培養(yǎng)箱按照正確方法進(jìn)行安裝、校準(zhǔn)、使用、維護(hù)。定期清潔，保證培養(yǎng)箱正常運(yùn)作，避免細(xì)胞污染。

 

● 培養(yǎng)箱需要定期使用消毒液擦拭內(nèi)表面進(jìn)行消毒，正常取放培養(yǎng)物均可以消毒雙手或門把手等。

● 培養(yǎng)箱的水盤定期滅菌，根據(jù)實(shí)際情況換水（高壓滅菌水或純水）。如出現(xiàn)培養(yǎng)箱污染，需要添加水盤清除劑（VivaCell，C3480-0100），必要時(shí)更換培養(yǎng)箱的濾芯等。

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水浴鍋使用注意事項(xiàng)

*所有放入水浴鍋的物品均要避免滲漏。如有滲漏需要及時(shí)換水，并做徹底消毒清潔，避免污染其他物品等。

 

● 水浴鍋使用注意用電安全。注意水位，避免空燒。

● 水浴鍋內(nèi)如出現(xiàn)異物，請(qǐng)及時(shí)清潔換水，如出現(xiàn)污染，請(qǐng)使用水浴鍋清除劑。

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離心機(jī)使用注意事項(xiàng)

*所有放入機(jī)器進(jìn)行離心的樣本均要進(jìn)行配平處理。嚴(yán)禁開蓋運(yùn)轉(zhuǎn)操作。

● 請(qǐng)選擇合適的轉(zhuǎn)子，離心時(shí)請(qǐng)保證液體體積不能超過離心管總體積的2/3。

● 離心機(jī)內(nèi)部如有冷凝水，請(qǐng)及時(shí)使用無塵紙擦拭。如遇液體樣本漏出，及時(shí)清潔干凈。

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9

其他試劑耗材使用注意事項(xiàng)

 

*所有細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中使用到的試劑耗材均需要無菌處理。如有重復(fù)使用的耗材，請(qǐng)按照正確的清洗、滅菌等程序進(jìn)行驗(yàn)證測(cè)試。 

 

● 細(xì)胞培養(yǎng)相關(guān)試劑正確儲(chǔ)存。為保證使用質(zhì)量，請(qǐng)?jiān)陂_封后盡快使用，避免質(zhì)量下降或者污染。

● 耗材產(chǎn)品需要正確保存，避免包裝破損導(dǎo)致產(chǎn)品污染。已經(jīng)開封外包裝的產(chǎn)品可保存于生物安全柜或超凈臺(tái)內(nèi)。

 

*以上設(shè)備、試劑或耗材的使用注意事項(xiàng)，僅與無菌相關(guān)的事項(xiàng)，其它注意事項(xiàng)請(qǐng)參考各自實(shí)驗(yàn)室信息。
 

END

 

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