ELISA實驗操作過程的不同影響因素分析
瀏覽次數(shù):738 發(fā)布日期:2023-11-7
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酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)是一種特殊的試劑分析方法,在免疫酶技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種新型的免疫測定技術(shù),其試劑易于保存、結(jié)果判斷較為客觀,是目前實驗室檢測抗原抗體最經(jīng)濟(jì)、最普遍的試驗診斷方法。其原理是將抗原(抗體)結(jié)合到固相載體表面,再將待測抗體(抗原)、酶標(biāo)抗原(抗體)與固相抗原(抗體)結(jié)合形成免疫復(fù)合物,經(jīng)洗滌使免疫復(fù)合物與待測抗體(抗原)呈比例,加入酶反應(yīng)底物使其與固相上的酶反應(yīng)變色,根據(jù)顏色做定性或定量分析,得出檢測結(jié)果。ELISA實驗操作過程極易影響結(jié)果,下面就操作的影響因素分析:
1、試劑的準(zhǔn)備
試劑的質(zhì)量如抗原抗體的純度及親和力、標(biāo)記物的比活性、滴度及特異性等直接影響檢測結(jié)果,為保證檢測質(zhì)量,所有試劑必需經(jīng)國家食品藥品監(jiān)督管理總局注冊批準(zhǔn)、批檢測合格,臨床評估特異性、敏感性、穩(wěn)定性較高且在有效期內(nèi)才有使用價值。不同廠家試劑敏感性、特異性不盡相同,有報道不同廠家酶標(biāo)板孔間 A 值差大小可達(dá) 15%,標(biāo)記酶的活性及顯色液的穩(wěn)定性也相差較大,所以合理有效的試劑選擇尤為重要,對 ELISA 試劑盒應(yīng)正確選擇,定期評價并建立科學(xué)的接收標(biāo)準(zhǔn),結(jié)合常規(guī)血液篩查情況,對實際的均一性、適用性、穩(wěn)定性,選出靈敏度、特異度及精密性合適的試劑保證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確。有報道不同廠家-IgG 配制成的抗 HCV-cAg 酶結(jié)合物溶液對檢測結(jié)果有區(qū)別,配制抗 HCV-cAg 酶結(jié)合物溶液前應(yīng)檢測小鼠-IgG 與產(chǎn)品的適配性。其次試劑盒的儲存方式、運(yùn)輸條件及有效期均為影響檢測結(jié)果的重要因素,試劑盒一般 2~8℃冰箱保存,注意不要緊貼冰箱儲存室后壁以防止試劑凍結(jié)失效,可避免使用時試劑受溫差影響導(dǎo)致酶標(biāo)板上凝集小水珠及反應(yīng)出現(xiàn)溫差而影響抗原抗體的反應(yīng)。使用前需將試劑盒放置 37℃恒溫箱溫育30min,且不同廠家、不同批號的試劑不能混合使用。剩余試劑應(yīng)及時放入干燥劑密封保存在 2~8℃冰箱,試劑打開后一周內(nèi)有效,同時注意做好室內(nèi)質(zhì)檢,確保實驗結(jié)果的可靠性。
不同方法學(xué)的檢驗試劑會使乙肝兩對半結(jié)果出現(xiàn)不同,如臨床操作中電化學(xué)檢測 HBsAg 呈陽性,而采用 ELISA 檢測則呈陰性,此外,使用單抗或多抗試劑對檢測結(jié)果同樣造成一定的影響。研究表明 ELISA 檢測細(xì)胞因子時需要根據(jù)檢測的細(xì)胞因子選擇不同的裂解液進(jìn)行處理,避免裂解液對細(xì)胞因子產(chǎn)生影響導(dǎo)致假陰性結(jié)果。
2、樣本的采集、保存及預(yù)處理
標(biāo)本的運(yùn)輸及保存、檢測人員的自身素質(zhì)均可能對檢測結(jié)果造成不良影響,為避免出現(xiàn)錯誤樣品應(yīng)準(zhǔn)確標(biāo)明編號、種類、受檢者姓名及采集時間,收集后認(rèn)真核對,拒收不符合要求的標(biāo)本及申請單,嚴(yán)格按照拒收制度處理,同時處理合格標(biāo)本,做好后續(xù)工作,避免延誤導(dǎo)致標(biāo)本出現(xiàn)溶血等其它不良情況。標(biāo)本的預(yù)處理對檢測結(jié)果有非常明顯的影響,臨床工作中有時為了快速得出檢測結(jié)果在血液開始凝固前強(qiáng)行離心分離血清,血清中殘留的纖維蛋白絲對實驗結(jié)果造成影響,標(biāo)本離心需徹底且必須待血液凝固后方能分離血清,也可在標(biāo)本采集時使用帶分離膠的采血管提取,使用未混入保存液的血液做檢測標(biāo)本。在此過程中保證待檢標(biāo)本新鮮、避免細(xì)菌污染,否則易出現(xiàn)假陽性結(jié)果,若不能及時檢測可將分離的血清于 4℃保存,超過一周于-20℃保存,避免反復(fù)凍融,防止出現(xiàn)假陰性結(jié)果。若血清中含有類風(fēng)濕因子或免疫復(fù)合物也將造成假陽性結(jié)果。
3、加樣
ELISA 檢測加樣時應(yīng)垂直將樣本準(zhǔn)確加入微孔底部,注意避免吸頭碰到酶標(biāo)板上的包被物,盡量慢吸快放,防止濺出或產(chǎn)生氣泡,避免液體外濺使血清殘留在反應(yīng)壁上。每次吸樣注意更換吸頭,做到一樣一吸頭,避免交叉污染,干吸頭每次加樣前在血清中抽吸三次保證吸樣準(zhǔn)確,滴加試劑時建議先將滴瓶搖勻擠去第一滴再加樣。加樣前先將微孔板平放在板架臺上,以免對洗板機(jī)的自動操作帶來影響,為了保證加樣的準(zhǔn)確性,建議使用準(zhǔn)確性高的微量移液器且定期進(jìn)行校正。加樣品稀釋液、酶結(jié)合物應(yīng)用液、底物應(yīng)用液及終止液時可采用定量多道加液器,迅速完成加液過程,加樣后用不干膠或膠帶紙封好酶標(biāo)板防止水分蒸發(fā)或雜物進(jìn)入孔內(nèi),注意封板膜不可二次利用,避免交叉污染,剩余的微孔板、不干膠或膠帶紙與干燥劑一同保存在備用自封塑料袋中。大批量檢測大型機(jī)構(gòu)體檢標(biāo)本時可采用直接加入適量血清的加樣模式,經(jīng)濟(jì)環(huán)保提高工作效率。
在實際操作過程中,待檢標(biāo)本和酶標(biāo)志物先后順序加入,于是在競爭法中因為兩者的不同時加入而存在一個“不公平”競爭現(xiàn)象,研究表明,競爭法 ELISA 檢測受加樣方法的影響存在統(tǒng)計學(xué)意義,將標(biāo)本和酶標(biāo)志物先在試管中等量混和均勻后再加入酶標(biāo)板小孔杯中可降低抗-HBc 檢測的假陽性率。
4、 溫育
溫育是 ELISA 至關(guān)重要的一步,不同的溫育環(huán)境對檢測結(jié)果有影響,操作中應(yīng)嚴(yán)格按照說明書控制溫育時間及溫度,并注意封閉避免邊緣效應(yīng)。為確保各板溫度都能迅速達(dá)到平衡,不可將反應(yīng)板疊加放置,設(shè)定的溫度及時間嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行,一般加入待測標(biāo)本后使其與固相抗原(抗體)置于 37℃環(huán)境下溫育。因為很多恒溫箱的構(gòu)造,溫度及檢測的溫度并非酶標(biāo)板溫育溫度,所以使用恒溫箱溫育時建議將溫度計置于酶標(biāo)板旁,保證酶標(biāo)板旁溫度為 37℃。干育和水溫的影響差異較為明顯,建議使用水溫,注意將固相板放入水中,防止受熱不均勻。
溫育時間是影響檢測結(jié)果的一大因素,實際操作過程中工作人員常常試圖縮短溫育時間提高工作效率,曹青梅等通過實驗證明,對于低濃度的標(biāo)本,待測標(biāo)本與固相抗體反應(yīng)時間過短,極易引起漏檢,反應(yīng)時間最少 30min 以上。羅保紅等報道,酶標(biāo)反應(yīng)預(yù)孵時間在溫室中不超過 15min,不但能保障 ELISA 檢測抗-HIV、抗-HCV 的實驗結(jié)果,還能提高試劑檢測的靈敏度。其傳統(tǒng)溫育采用水溫箱易受污染,現(xiàn)多采用電熱、電子恒溫培養(yǎng)箱溫育,研究表明溫育方式對 ELISA 檢測物影響。陳懷霞報道,ELISA 檢測中,溫度對抗原、抗體及酶反應(yīng)的影響很大,溫度增高,分子運(yùn)動加速,并可能出現(xiàn)非特異性反應(yīng),出現(xiàn)假陰性或者假陽性結(jié)果,檢測控制恒溫 37℃可保證檢測的準(zhǔn)確性。
5、 洗板
洗板目的在于將特異性結(jié)合于固相上的抗原(抗體)與溫育過程中吸附的非特異性成份分離,使免疫復(fù)合物與待測抗體(抗原)呈一定比例,洗板是否合格直接影響檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。洗板應(yīng)嚴(yán)格按照說明控制洗板時間及洗板次數(shù), ELISA 檢測一般用洗滌液洗板 3 次,洗滌液應(yīng)嚴(yán)格按照操作說明進(jìn)行稀釋,洗液應(yīng)注滿每個微孔并注意洗液不外溢,垂直甩板避免交叉污染,防止出現(xiàn)假陰性及假陽性結(jié)果。使用洗板機(jī)洗板可一定程度上避免環(huán)境污染、提高工作效率,洗滌開始時注意觀察每根吸液針是否一直插入孔底并吸干孔內(nèi)全部液體,嚴(yán)格按照要求設(shè)置一定的洗板時間及洗板次數(shù)。洗板過程中注意沖力大小,避免沖力過大導(dǎo)致酶結(jié)合物丟失,吸光度值偏低。洗液應(yīng)根據(jù)不同廠家的酶標(biāo)板調(diào)整注水量,注意不要溢出孔外;稀釋洗液所用的蒸餾水或去離子水酸堿度適中,使配出的洗液 pH 在 7.2~7.6 范圍內(nèi),用非金屬容器保存,保持液體新鮮無污染、沉淀。洗板結(jié)束后將板拍干,應(yīng)垂直扣在備好的干凈的吸水紙或毛巾上,且注意每次更新干凈的吸水紙或毛巾。
洗板時還應(yīng)注意以下問題:
(1)、 需每天校正注液量及殘液量,洗滌后殘液量不得大于 2μl;
(2)、及時更換破損吸液針,避免破壞底板包被;
(3)、針對不同廠家酶標(biāo)板注意調(diào)整吸液頭下降高度,避免沖洗針頭卡住酶標(biāo)板;
(4)、注意調(diào)整洗液量,洗液量過多將溢出,過少將達(dá)不到洗滌效果;
(5)、關(guān)機(jī)前使用蒸餾水沖洗管道,避免洗液的結(jié)晶物堵塞管道;
(6)、 不同種試劑盒的洗液嚴(yán)禁混合使用。臨床操作中,工作人員由于擔(dān)心洗板次數(shù)過少達(dá)不到去除非特異性物質(zhì)的理想效果而增加洗板次數(shù),最近研究發(fā)現(xiàn),隨著洗板次數(shù)的增加樣本檢測的 OD 值降低,造成假陰性結(jié)果及灰區(qū)標(biāo)本的漏檢。
6、 顯色及結(jié)果判斷
試劑顯色時 A、B 液按順序加入且間隔不超過 10min,如先將兩液混合再加樣則需保證等體積混合。顯色劑不宜過多,注意避光反應(yīng)。顯色是最后一步溫育反應(yīng),酶將無色底物催化反應(yīng)呈有色,反應(yīng)的溫度和時間均為影響結(jié)果的重要因素,目前市場上大多數(shù)進(jìn)口的 ELISA 檢測顯色溫度處于 18~30℃。一定時間內(nèi),陰性孔可保持無色,但陽性孔會隨時間的延長而顯色加強(qiáng)。研究表明,顯色溫度對實驗結(jié)果有明顯影響,顯色溫度不同,試劑最低檢測能力差距非常大,溫度低于 21℃時試劑盒對于質(zhì)控物的檢出能力下降,溫度過低導(dǎo)致結(jié)合反應(yīng)速率變慢,顯色不充分,造成低值陽性結(jié)果的漏檢,所以操作中應(yīng)嚴(yán)格控制溫度。顯色時間不宜過短,因為一些低滴度可能不能及時出現(xiàn)反應(yīng),造成假陰性結(jié)果。結(jié)果判斷應(yīng)按照說明書在規(guī)定時間內(nèi)完成,研究報道終止反應(yīng)后的時間對 OD 值結(jié)果有明顯影響,10~15min陽性結(jié)果 OD 值逐漸下降,陰性結(jié)果的 OD 值有所上升,所以必須嚴(yán)格按照操作說明進(jìn)行,薛春楊等認(rèn)為結(jié)果判斷需在加入終止液后 10min 內(nèi)完成,避免出現(xiàn)孔內(nèi)結(jié)晶影響酶標(biāo)儀的測試,避免強(qiáng)光下進(jìn)行。
在加液和混合過程中產(chǎn)生氣泡、微孔條底部不透明、帶水滴、有劃痕及不規(guī)則的表面都可能引起吸光值的升高,易造成假陽性結(jié)果,若顯色但酶標(biāo)儀讀值為陰性的灰色值樣區(qū)的樣本不管其是否來源于高危人群均需復(fù)檢并參考參比試劑。
7、其它因素
實驗室的環(huán)境亦是影響試驗結(jié)果的一大因素,合理控制實驗室的通風(fēng)、采光及防塵,實驗室的溫度及濕度可使用空調(diào)加以控制,濕度控制在 35%~65%間,并避免噪音及電磁波干擾。
檢測結(jié)果對受檢者的家庭、生活及工作非常重要,可能帶來嚴(yán)重的精神痛苦及巨大的心理壓力,因此檢驗工作者應(yīng)不斷提高自身素質(zhì),加強(qiáng)使命感與責(zé)任心,盡職盡責(zé)認(rèn)真對待每一份待檢標(biāo)本,嚴(yán)格按照實驗室的標(biāo)準(zhǔn)化操作,試劑的選擇和準(zhǔn)備、樣品的采集和儲存、操作等方面,嚴(yán)格按照說明書要求,規(guī)范化操作,同時做好實驗室內(nèi)質(zhì)控、室間質(zhì)評,排除影響因素,嚴(yán)格控制試驗環(huán)境,牢牢把關(guān)試劑選擇、試驗溫度、儀器設(shè)備等每一環(huán)節(jié),最大限度地降低檢測的系統(tǒng)誤差,加強(qiáng)自身理論知識的學(xué)習(xí),在工作中總結(jié)經(jīng)驗、揚(yáng)長避短,減少人為因素對試驗結(jié)果造成影響,提高檢測的準(zhǔn)確性,減少假陰性、假陽性結(jié)果的出現(xiàn)。
ELISA 檢測廣泛應(yīng)用于乙肝、丙肝、梅毒、艾滋以及結(jié)核等傳染類疾病的診斷,對于含有疑似干擾物的待檢樣本做相應(yīng)分析,在保證結(jié)果可靠的前提下盡量避免二次抽血。為保證檢驗工作者的自身安全,操作時必須帶好口罩、手套,穿好工作衣,嚴(yán)格進(jìn)行規(guī)范操作,防止交叉感染。有條件的情況下可使用酶聯(lián)免疫反應(yīng)加速儀縮短反應(yīng)時間,提高工作效率。