ELISA試劑盒不同實(shí)驗(yàn)樣本類(lèi)型處理方法
常規(guī)用于ELISA實(shí)驗(yàn)的樣本包含血清、血漿、細(xì)胞培養(yǎng)上清、尿液以及組織勻漿等。不同樣本類(lèi)型的預(yù)處理方法存在差異，合適的樣本預(yù)處理是確保ELISA實(shí)驗(yàn)正確性和準(zhǔn)確性的第一步。下面將介紹幾種不同樣本類(lèi)型的處理方法。
1. 血清
血清是ELISA實(shí)驗(yàn)最常用的樣本，其預(yù)處理也十分簡(jiǎn)單。
使用無(wú)熱原無(wú)內(nèi)毒素的試管或離心管采集血液樣本，將試管或離心管在室溫下放置2小時(shí)或4℃過(guò)夜，分離出血清（建議傾斜試管或離心管以擴(kuò)大液面的橫截面，使血清可以更大程度地分離出來(lái)）。2-8℃下以1000×g離心20分鐘，小心收集上清液（血清），立即進(jìn)行測(cè)定。建議在-20℃或-80℃下將收集的血清分裝保存，避免反復(fù)凍融。
在收集血液樣本的過(guò)程中應(yīng)避免溶血，因?yàn)榧t細(xì)胞在溶解時(shí)會(huì)釋放具有過(guò)氧化物酶活性的物質(zhì)，這種情況下，ELISA實(shí)驗(yàn)中將會(huì)出現(xiàn)非特異性顯色反應(yīng)，導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果不準(zhǔn)確。另外，樣本還應(yīng)避免細(xì)菌污染，因?yàn)榧?xì)菌可能含有內(nèi)源性HRP，也會(huì)導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果不準(zhǔn)確。
2. 血漿
使用含抗凝劑的采血管或離心管采集血液樣本，采集后30分鐘內(nèi)，2-8℃下以1000×g離心15分鐘，小心收集上清液（血漿）。建議在-20℃或-80℃下將收集的血漿分裝保存，避免反復(fù)凍融。樣本應(yīng)避免溶血或高血脂。常見(jiàn)的抗凝劑包括EDTA鈉鹽，肝素鈉，枸櫞酸鈉等。檢測(cè)前請(qǐng)仔細(xì)閱讀ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)，查看該試劑盒針對(duì)抗凝劑是否有特殊要求。
3. 細(xì)胞培養(yǎng)上清
將細(xì)胞培養(yǎng)上清液吸入離心管中，在2-8℃下以1000×g離心20分鐘，除去細(xì)胞碎片和雜質(zhì)，收集上清液備用，樣本保存在-20℃或-80℃，避免反復(fù)凍融。
4. 細(xì)胞提取液
反復(fù)凍融方法
1） 吸出培養(yǎng)板中的培養(yǎng)基，用胰蛋白酶消化細(xì)胞，然后加入適量的培養(yǎng)基將培養(yǎng)板上的細(xì)胞沖洗干凈。懸浮細(xì)胞可以省略該步驟。
2） 將細(xì)胞懸浮液收集到離心管中，在2-8℃下以1000×g離心5分鐘，然后吸去培養(yǎng)基，用預(yù)冷PBS洗滌細(xì)胞3次。
3） 加入適量的預(yù)冷PBS（建議在使用前立即加入蛋白酶抑制劑）重懸細(xì)胞。在6孔培養(yǎng)板（約1×106個(gè)細(xì)胞）中，每個(gè)孔加入150-250μL的PBS來(lái)重懸細(xì)胞。
4） 使樣本在-20℃或-80℃條件和室溫條件下反復(fù)凍融，重復(fù)凍融過(guò)程數(shù)次，直至細(xì)胞完全裂解。也可以使用超聲波細(xì)胞破碎器超聲處理懸浮液來(lái)裂解細(xì)胞。
5） 2-8℃下以1500×g離心10分鐘，去除細(xì)胞碎片，收集上清液，-20℃或-80℃保存，避免反復(fù)凍融。
5. 組織勻漿
1） 用預(yù)冷的PBS（0.01M，PH7.4）沖洗組織以除去表面殘留的血液或雜質(zhì)（勻漿中裂解的紅細(xì)胞會(huì)影響測(cè)量結(jié)果）。
2） 將組織塊稱(chēng)重，然后切成盡可能小的碎塊，以便充分勻漿。
3） 加入適量的預(yù)冷PBS（一般按1:9的重量體積比，比如1g的組織樣品對(duì)應(yīng)9mL的PBS，具體體積可根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要適當(dāng)調(diào)整，并做好記錄。推薦在PBS中加入蛋白酶抑制劑），用玻璃勻漿器在冰上或冰浴中充分勻漿。為了進(jìn)一步裂解組織細(xì)胞，可以對(duì)勻漿液進(jìn)行超聲破碎，或反復(fù)凍融。
4） 將勻漿液吸入離心管中，2-8℃下以5000×g離心5分鐘，收集上清液，保存至-20℃或-80℃，避免反復(fù)凍融。
6. 唾液
在2-8℃下，4000×g離心10分鐘以去除雜質(zhì)，取上清即可檢測(cè)。建議使用新鮮的唾液樣本檢測(cè)。
7. 尿液
使用無(wú)菌容器收集尿液樣本。在2-8℃下，1000×g離心15分鐘以去除雜質(zhì)，取上清即可檢測(cè)。
8. 糞便
將糞便樣本用PBS(0.01M, pH=7.4)重懸,置于冰上振蕩15分鐘,然后在2-8℃，5000×g離心5分鐘，取上清即可檢測(cè)。
9. 其他生物體液
1. 血清
血清是ELISA實(shí)驗(yàn)最常用的樣本，其預(yù)處理也十分簡(jiǎn)單。
使用無(wú)熱原無(wú)內(nèi)毒素的試管或離心管采集血液樣本，將試管或離心管在室溫下放置2小時(shí)或4℃過(guò)夜，分離出血清（建議傾斜試管或離心管以擴(kuò)大液面的橫截面，使血清可以更大程度地分離出來(lái)）。2-8℃下以1000×g離心20分鐘，小心收集上清液（血清），立即進(jìn)行測(cè)定。建議在-20℃或-80℃下將收集的血清分裝保存，避免反復(fù)凍融。
在收集血液樣本的過(guò)程中應(yīng)避免溶血，因?yàn)榧t細(xì)胞在溶解時(shí)會(huì)釋放具有過(guò)氧化物酶活性的物質(zhì)，這種情況下，ELISA實(shí)驗(yàn)中將會(huì)出現(xiàn)非特異性顯色反應(yīng)，導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果不準(zhǔn)確。另外，樣本還應(yīng)避免細(xì)菌污染，因?yàn)榧?xì)菌可能含有內(nèi)源性HRP，也會(huì)導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果不準(zhǔn)確。
2. 血漿
使用含抗凝劑的采血管或離心管采集血液樣本，采集后30分鐘內(nèi)，2-8℃下以1000×g離心15分鐘，小心收集上清液（血漿）。建議在-20℃或-80℃下將收集的血漿分裝保存，避免反復(fù)凍融。樣本應(yīng)避免溶血或高血脂。常見(jiàn)的抗凝劑包括EDTA鈉鹽，肝素鈉，枸櫞酸鈉等。檢測(cè)前請(qǐng)仔細(xì)閱讀ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)，查看該試劑盒針對(duì)抗凝劑是否有特殊要求。
3. 細(xì)胞培養(yǎng)上清
將細(xì)胞培養(yǎng)上清液吸入離心管中，在2-8℃下以1000×g離心20分鐘，除去細(xì)胞碎片和雜質(zhì)，收集上清液備用，樣本保存在-20℃或-80℃，避免反復(fù)凍融。
4. 細(xì)胞提取液
反復(fù)凍融方法
1） 吸出培養(yǎng)板中的培養(yǎng)基，用胰蛋白酶消化細(xì)胞，然后加入適量的培養(yǎng)基將培養(yǎng)板上的細(xì)胞沖洗干凈。懸浮細(xì)胞可以省略該步驟。
2） 將細(xì)胞懸浮液收集到離心管中，在2-8℃下以1000×g離心5分鐘，然后吸去培養(yǎng)基，用預(yù)冷PBS洗滌細(xì)胞3次。
3） 加入適量的預(yù)冷PBS（建議在使用前立即加入蛋白酶抑制劑）重懸細(xì)胞。在6孔培養(yǎng)板（約1×106個(gè)細(xì)胞）中，每個(gè)孔加入150-250μL的PBS來(lái)重懸細(xì)胞。
4） 使樣本在-20℃或-80℃條件和室溫條件下反復(fù)凍融，重復(fù)凍融過(guò)程數(shù)次，直至細(xì)胞完全裂解。也可以使用超聲波細(xì)胞破碎器超聲處理懸浮液來(lái)裂解細(xì)胞。
5） 2-8℃下以1500×g離心10分鐘，去除細(xì)胞碎片，收集上清液，-20℃或-80℃保存，避免反復(fù)凍融。
5. 組織勻漿
1） 用預(yù)冷的PBS（0.01M，PH7.4）沖洗組織以除去表面殘留的血液或雜質(zhì)（勻漿中裂解的紅細(xì)胞會(huì)影響測(cè)量結(jié)果）。
2） 將組織塊稱(chēng)重，然后切成盡可能小的碎塊，以便充分勻漿。
3） 加入適量的預(yù)冷PBS（一般按1:9的重量體積比，比如1g的組織樣品對(duì)應(yīng)9mL的PBS，具體體積可根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要適當(dāng)調(diào)整，并做好記錄。推薦在PBS中加入蛋白酶抑制劑），用玻璃勻漿器在冰上或冰浴中充分勻漿。為了進(jìn)一步裂解組織細(xì)胞，可以對(duì)勻漿液進(jìn)行超聲破碎，或反復(fù)凍融。
4） 將勻漿液吸入離心管中，2-8℃下以5000×g離心5分鐘，收集上清液，保存至-20℃或-80℃，避免反復(fù)凍融。
6. 唾液
在2-8℃下，4000×g離心10分鐘以去除雜質(zhì)，取上清即可檢測(cè)。建議使用新鮮的唾液樣本檢測(cè)。
7. 尿液
使用無(wú)菌容器收集尿液樣本。在2-8℃下，1000×g離心15分鐘以去除雜質(zhì)，取上清即可檢測(cè)。
8. 糞便
將糞便樣本用PBS(0.01M, pH=7.4)重懸,置于冰上振蕩15分鐘,然后在2-8℃，5000×g離心5分鐘，取上清即可檢測(cè)。
9. 其他生物體液
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