免疫細(xì)胞培養(yǎng)的六個(gè)基本流程：樣本制備、細(xì)胞分選、分型鑒定、擴(kuò)增&培養(yǎng)、質(zhì)量優(yōu)化、后續(xù)研究。10月7日，小優(yōu)給大家詳細(xì)分享了《免疫細(xì)胞培養(yǎng)通關(guān)技巧之樣本制備》，今天繼續(xù)通關(guān)第二關(guān)：細(xì)胞分選。
 

細(xì)胞分選（Cell Sorting）：根據(jù)細(xì)胞所具有的特性把某種特定的細(xì)胞亞群從混合的細(xì)胞樣品中分離出來的一種技術(shù)，它是對某一特定細(xì)胞進(jìn)行生化分析和功能分析的前提和基礎(chǔ)。
 

在進(jìn)行細(xì)胞分選前，我們要明確目的細(xì)胞占比、標(biāo)記物、選擇何種分選方法。
 

目的細(xì)胞占比：不僅涉及到樣本的選擇，也關(guān)乎我們是否進(jìn)行樣本的預(yù)富集，這部分內(nèi)容我們在樣本制備篇章已經(jīng)給大家列舉出來了。
 

免疫細(xì)胞標(biāo)記物：人免疫細(xì)胞分型標(biāo)記物圖譜基本上涵蓋了所有的免疫細(xì)胞及鑒定標(biāo)記物，需要的小伙伴快快拿走！

 

圖1 人免疫細(xì)胞分型標(biāo)記物圖譜

 

目前細(xì)胞分選的常規(guī)方法分為四種：磁珠分選（Magnetic Cell Separation）、流式分選（Fluorescence-activated Cell Sorting）、免疫密度梯度細(xì)胞分選（Immunodensity Cell Isolation）、微流控細(xì)胞分選（Microfluidic Cell Sorting）。小優(yōu)在這里也給大家匯總了四種方法的原理以及優(yōu)缺點(diǎn)。

 

表1 四種細(xì)胞分選方法的比較

 

由于磁珠分選和流式分選是現(xiàn)在細(xì)胞分選最常用的，接下來給大家詳細(xì)介紹這兩種方法的分選策略。

 

圖2 磁珠分選（左）、流式分選（右）原理示意圖（圖片來源網(wǎng)絡(luò)）

 

磁珠分選的分選策略：陽性分選、陰性分選、多重分選、全血分選。
 

陽性分選：目的細(xì)胞被磁珠標(biāo)記后，作為陽性組分直接分選出來。分選后的細(xì)胞不必去除MACS微珠，可立即用于培養(yǎng)或者后續(xù)操作。該方法可以將磁性標(biāo)記的靶細(xì)胞富集10000倍。陽性分選的純度更好，尤其是針對某些需要富集的稀有細(xì)胞，回收率也更高。

 

圖3 磁珠分選中陽性分選示意圖（圖片來源Miltenyi官網(wǎng)）

 

陰性分選：磁性標(biāo)記非目的細(xì)胞，將其從細(xì)胞混合物中去除，即為磁性標(biāo)記的細(xì)胞為目的細(xì)胞，陰性分選也稱為去除分選。
 

適用范圍：去除不需要的細(xì)胞；缺乏針對目的細(xì)胞的特異性抗體(如腫瘤細(xì)胞)；不需要抗體和目的細(xì)胞結(jié)合，即細(xì)胞不被激活(如T細(xì)胞、B細(xì)胞、NK細(xì)胞功能分析)。

 

圖4 磁珠分選中陰性分選示意圖（圖片來源Miltenyi官網(wǎng)）

 

多重分選：有兩種方案：方案一：陰性分選+陽性分選，即先去除部分非目的細(xì)胞，再進(jìn)行陽性分選；方案二：多選磁珠+陽/陰性分選，即先用多選磁珠陽性分選細(xì)胞，剪切去除磁珠后，再對分選的細(xì)胞進(jìn)行二次分選；或者直接使用Miltenyi可自動解離的REAlease磁珠，無需手動剪切，即可進(jìn)行二次分選。
 

適用范圍：在細(xì)胞懸液中，非目的細(xì)胞也表達(dá)用來陽性選擇目的細(xì)胞的抗原，就需要先去除這群非目的細(xì)胞，或者選擇多選磁珠/REAlease磁珠，解離細(xì)胞表面的磁珠后，再對分選后的細(xì)胞進(jìn)行二次分選；如果要分選非常稀有細(xì)胞，先從細(xì)胞懸液中去除非目的細(xì)胞，在富集細(xì)胞的基礎(chǔ)上，進(jìn)行陽性分選，可獲得高純度目的細(xì)胞。

 

圖5 磁珠分選中多重分選示意圖（上：陰性分選+陽性分選；下：多選磁珠+陽/陰性分選）（圖片來源Miltenyi官網(wǎng)）

 

全血分選：傳統(tǒng)方法從外周血中分選細(xì)胞，需要先制備PBMC，再進(jìn)行后續(xù)的磁珠分選或者流式分選，操作時(shí)間長達(dá)2 h。美天旎含有一款全血磁珠，無需裂解紅細(xì)胞，無需密度梯度離心，30 min之內(nèi)即可獲得活性好、得率高的目的細(xì)胞。

 

圖6 磁珠分選中全血分選示意圖（圖片來源Miltenyi官網(wǎng)）

 

流式分選的分選策略：流式分選的步驟相對來說比較固定：1.制備單細(xì)胞懸液；2.細(xì)胞染色；3.細(xì)胞分選；4.后續(xù)細(xì)胞培養(yǎng)、分析。

 

圖7 流式分選的基本步驟 （圖片來源網(wǎng)絡(luò)）

 

其中比較困難的就是關(guān)于抗體偶聯(lián)熒光素的選擇，很多老師會遇到這種情況，確定好了要分選的細(xì)胞的marker，但是偶聯(lián)的熒光素不知道怎么選。一般來說需要遵循三個(gè)原則：

1.根據(jù)儀器配置選擇熒光素：多色標(biāo)記熒光素搭配時(shí)還應(yīng)當(dāng)每個(gè)通道只選擇一種熒光素；各個(gè)通道之間的熒光素可以互相搭配；

2.根據(jù)抗原表達(dá)強(qiáng)弱合理分配熒光素：即抗原為高表達(dá)的話，可以將其與熒光強(qiáng)度較低的熒光素抗體相結(jié)合；

3.選擇光譜重疊小的熒光素：由于熒光素的寬發(fā)射譜的特點(diǎn)，熒光通道間有光譜重疊現(xiàn)象，因此選擇熒光素組合時(shí)要將光譜疊加可能性減到最低。多色流式實(shí)驗(yàn)的時(shí)候往往需要通過補(bǔ)償調(diào)節(jié)消除光譜重疊的影響。

 

圖8激發(fā)光及對應(yīng)熒光素介紹（圖片來源優(yōu)寧維）

 

這里給大家匯總一些流式分選的tips：

• 因?yàn)榉诌x得到的細(xì)胞還要繼續(xù)培養(yǎng)，所以務(wù)必保證樣本的無菌狀態(tài)；
• 不能使用固定劑固定細(xì)胞，因?yàn)榛罴?xì)胞經(jīng)固定劑處理后即死亡；
• 細(xì)胞重懸液中加入PH調(diào)節(jié)劑HEPES（終濃度25mM，PH調(diào)節(jié)范圍6.8-8.2），減少高壓對PH的改變；
• 鞘液中避免含有抑菌劑，如乙醇胺類物質(zhì)，以免影響細(xì)胞活性；
• 如細(xì)胞分選后需再次培養(yǎng)，需準(zhǔn)備含血清的收集管；保證分選完畢時(shí)血清濃度大于5%；
• 如要去除死細(xì)胞，在不影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)前提下，可加入7-AAD、PI或DAPI；

當(dāng)然，磁珠分選和流式分選也不是完全獨(dú)立的，我們也可以先選擇美天旎磁珠進(jìn)行陽性分選，富集目的細(xì)胞之后，再標(biāo)記對應(yīng)的流式抗體進(jìn)行進(jìn)一步的流式分選。這種方法的適用范圍主要是低頻稀有細(xì)胞，希望獲得更高的純度。

 

了解了兩大常用的細(xì)胞分選方法后，我們應(yīng)當(dāng)如何選擇呢？

流式分選可進(jìn)行多參數(shù)分選以及不同熒光強(qiáng)度的分選，但對設(shè)備要求較高，對細(xì)胞刺激較大但分選靈活可以達(dá)到多方面的分選要求；磁珠分選操作簡單，分選速度快，細(xì)胞活性好，對設(shè)備和技術(shù)員的要求較低，但只能根據(jù)一個(gè)參數(shù)進(jìn)行分選，而且也不能針對細(xì)胞胞內(nèi)標(biāo)記物進(jìn)行篩選。這里小優(yōu)也給大家詳細(xì)對比了流式分選和磁珠分選的優(yōu)劣勢：

 

圖9流式分選與磁珠分選的比較（圖片來源優(yōu)寧維）

 

一般來說，如果磁珠分選能達(dá)到研究要求，一般首選磁珠分選，若磁珠分選達(dá)不到要求則再考慮用流式進(jìn)行分選。
 

最后以磁珠分選PBMCs樣本中人Tregs細(xì)胞為例，幫助大家更好的get要點(diǎn)：

Tregs是CD4+ T細(xì)胞的一個(gè)亞群，它最特異性的標(biāo)簽是核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子Foxp3，此外，它還高表達(dá)IL-2α受體(IL2Rα)—CD25，因此，經(jīng)典的Treg標(biāo)志是CD4+ CD25+ Foxp3+ T。如果我們檢測Tregs細(xì)胞，可以選擇膜標(biāo)記及核標(biāo)記同時(shí)鑒定，但如果我們需要分選Tregs細(xì)胞并進(jìn)行后續(xù)的培養(yǎng)，那就無法借助核轉(zhuǎn)錄因子Foxp3了，因?yàn)榇胖榉诌x只能進(jìn)行膜蛋白的標(biāo)記，流式分選標(biāo)記Foxp3時(shí)，需要固定、透化步驟，會導(dǎo)致細(xì)胞死亡。所以分選Tregs細(xì)胞選擇的標(biāo)記物一般為：表面蛋白CD4、CD25。

好啦，免疫細(xì)胞培養(yǎng)通關(guān)技巧之細(xì)胞分選的內(nèi)容也給大家介紹完了，下一個(gè)分型鑒定，我們不見不散呀！