細(xì)胞端粒酶活性檢測(cè)——細(xì)胞成瘤性檢測(cè)

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一、端粒

端粒（telomere）位于真核細(xì)胞染色體末端，其 DNA 序列高度保守。端�？蓽p少末端縮短，亦可避免相鄰染色體末端融合，在細(xì)胞增殖及衰老等過程中發(fā)揮重要作用。人體細(xì)胞每分裂 1 次，端�？s短 50～100 bp，當(dāng)端粒長(zhǎng)度縮短到傷害 DNA 的臨界值而細(xì)胞又無法補(bǔ)償此長(zhǎng)度縮短時(shí)，染色體穩(wěn)定性變差，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡、機(jī)體衰老。
 

二、端粒酶

端粒酶是一種RNA依賴性DNA聚合酶和逆轉(zhuǎn)錄酶，由RNA和蛋白質(zhì)組成，可維持端粒長(zhǎng)度（Greider and Blackburn 1989）。端粒酶以自身RNA為模板，合成端粒DNA，從而使細(xì)胞獲得無限增殖。其主要由 3 部分組成[即人端粒酶RNA（humane telomerase RNA component, hTERC）、端粒酶協(xié)同蛋白（humane telomerase associated protein, hTEP1）及端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（human e telomerase reverse transcriptase, hTERT）]，其中hTERT被認(rèn)為是端粒酶活性表達(dá)的關(guān)鍵組分，hTERT編碼的 mRNA 水平與端粒酶整體活性一致。因此，可以用hTERT亞基的mRNA水平基因表達(dá)量來衡量端粒酶活性。hTERT和hTERC對(duì)于端粒維持和延伸的催化活性是必要和充分的（Lingn er等, 1997; Weinrich等, 1997）。DKC1是端粒酶復(fù)合體的一個(gè)重要組成部分，屬于協(xié)同蛋白之一，在正常端粒功能的維持、前體rRNA的加工、正常核糖體生物合成以及基因轉(zhuǎn)錄后修飾等過程中發(fā)揮重要作用。

三、端粒酶活性的組織特異性

端粒酶在細(xì)胞中的主要生物學(xué)功能是通過其逆轉(zhuǎn)錄酶活性復(fù)制和延長(zhǎng)端粒DNA，穩(wěn)定染色體端粒DNA的長(zhǎng)度。端粒酶的活性在真核細(xì)胞中可檢測(cè)到，其功能是合成染色體末端的端粒，使因每次細(xì)胞分裂而逐漸縮短的端粒長(zhǎng)度得以補(bǔ)償，進(jìn)而穩(wěn)定端粒長(zhǎng)度。

然而，大多數(shù)人類體細(xì)胞并不主動(dòng)表達(dá)這種酶。在人類研究中，一些常用于分析端粒長(zhǎng)度的細(xì)胞類型是血淋巴細(xì)胞和其他單核細(xì)胞，通常稱為外周血單核細(xì)胞（PBMC）。這些細(xì)胞被激活時(shí)能夠上調(diào)端粒酶活性。端粒長(zhǎng)度和端粒酶活性這兩個(gè)因素都是在不同的分子水平上獨(dú)立調(diào)節(jié)的，它們之間復(fù)雜的相互作用還不完全清楚，例如氧化應(yīng)激、TPE和TERRA都會(huì)干擾它們。

端粒酶-酶復(fù)合物的高度保守和嚴(yán)格調(diào)控的催化亞基TERT通過RNA模板反向轉(zhuǎn)錄端粒六核苷酸來維持和恢復(fù)端粒長(zhǎng)度（Smogorzewska and Delange, 2004）。然而，人體內(nèi)只有生殖干細(xì)胞和癌細(xì)胞表達(dá)足夠水平的端粒酶以完全維持端粒長(zhǎng)度（Kim等, 1994）。人端粒酶以組織特異性方式表達(dá)，并在衰老過程中減少端粒酶陽性的細(xì)胞類型（Lin等, 2015；Young等, 2003）。人胚胎組織中，端粒酶活性最高，并且隨著年齡增長(zhǎng)，端粒酶活性逐漸降低（肝臟組織除外）。在某些成人細(xì)胞如淋巴細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和成人干細(xì)胞中仍可檢測(cè)到端粒酶活性。生殖細(xì)胞中的端粒酶活性也很高，因?yàn)樾枰�確保后代的端粒足夠長(zhǎng)。而胚胎干細(xì)胞也具有高端粒酶活性的特點(diǎn)，這是其能夠在細(xì)胞培養(yǎng)條件下在體外持續(xù)生長(zhǎng)的基礎(chǔ)。

腫瘤發(fā)生過程中，端粒酶活性高度上調(diào)，在大多數(shù)癌癥腫瘤組織中，端粒酶活性較高。這種活性升高的狀態(tài)，使得端粒長(zhǎng)度得以維持，即使在癌細(xì)胞中端粒長(zhǎng)度很短，也能使細(xì)胞無限期生長(zhǎng)。因此，端粒酶活性是細(xì)胞永生的重要先決條件。

四、檢測(cè)意義

1、臨床上：可檢測(cè)是否有腫瘤

2、工業(yè)客戶：間接考察細(xì)胞是否有成瘤的可能性

五、端粒酶活性檢測(cè)的主要方案

1、直接檢測(cè)端粒酶（蛋白及RNA的結(jié)合復(fù)合物）的活性，檢測(cè)它是否可以延伸DNA模板，然后跑膠或者探針雜交，檢測(cè)DNA延伸的長(zhǎng)度，以此來判斷端粒酶的活性高低。（TRAP法）

優(yōu)缺點(diǎn)：該方法需要提取蛋白，操作較復(fù)雜，靈敏度不高；放射性同位素標(biāo)記；重復(fù)性差、周期長(zhǎng)等。

2、間接檢測(cè)端粒酶（催化亞基的mRNA量）的活性。

優(yōu)缺點(diǎn)：該方法靈敏度高，操作相對(duì)簡(jiǎn)便；但是在多數(shù)細(xì)胞中，端粒酶催化亞基的表達(dá)很難檢測(cè)到。

六、翼和端粒酶活性檢測(cè)

1、檢測(cè)原理

雙色熒光探針分別檢測(cè)端粒酶催化亞基TERT基因mRNA和內(nèi)參基因GAPDH mRNA。在進(jìn)行樣本檢測(cè)時(shí)，同時(shí)檢測(cè)陽性細(xì)胞293T和陰性MRC-5細(xì)胞做為對(duì)照，利用∆∆CT法計(jì)算樣本中TERT基因的相對(duì)表達(dá)量。

2、檢測(cè)結(jié)果展示

3、定量PCR擴(kuò)增曲線