摘要
我們使用細(xì)胞活性測定來研究生物活性分子的效力或毒性。而發(fā)光 CellTiter-Glo® (CTG) 檢測一種廣泛用于測量細(xì)胞活性的技術(shù)。 它是一種基于 ATP 定量的均相方法，ATP 是代謝活躍細(xì)胞的指標(biāo)。然而，在需要延長培養(yǎng)時(shí)間的多個(gè)時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞活性研究中，CTG 往往會(huì)變干并形成堵塞物。在本研究中，我們檢查和比較了使用兩種試劑分配器 - Multidrop® Combi (ThermoFisher) 和 TEMPEST® (FORMULATRIX®) - 進(jìn)行的長時(shí)間培養(yǎng) CTG 檢測的結(jié)果。
 
介紹
CellTiter-Glo 是一種常用的細(xì)胞活性檢測方法，可將 ATP 水平量化為代謝活動(dòng)的指標(biāo)。測定的同質(zhì)“添加-混合-檢測”形式使其非常適合自動(dòng)化。但是，重構(gòu)的 CellTiter-Glo 試劑是一種濃縮的預(yù)混液，如果干燥，很容易堵塞分液器。這對(duì)延長細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間的自動(dòng)化測定提出了挑戰(zhàn)，因?yàn)樵谂囵B(yǎng)期間分液器保持待機(jī)狀態(tài)，很容易堵塞并需要人工處理解決。
 
Multidrop® Combi 是一款廣泛使用的快速八通道蠕動(dòng)分液器，在分配 2 μL 液體時(shí)一般具有的 ±10% 的不準(zhǔn)確度和不精確度。
 
TEMPEST（圖 1）是一款非接觸式液體分配器，可配置多達(dá) 12 個(gè)微型隔膜芯片，這些芯片分液由多達(dá) 96 個(gè)獨(dú)立控制的噴嘴共同完成。 TEMPEST 芯片與多種試劑兼容，粘度高達(dá) 25 cP（70% 甘油，20 C），能夠以高精度和高精度分配小體積溶液（表 1）。  
芯片的設(shè)計(jì)實(shí)現(xiàn)了試劑的雙向運(yùn)動(dòng)：a) 從儲(chǔ)液器通過噴嘴分配 b) 在噴嘴關(guān)閉的情況下在儲(chǔ)液器和芯片之間進(jìn)行再循環(huán)。即使在儀器沒有分液的情況下，TEMPEST 的再循環(huán)功能也能保證芯片內(nèi)的液體移動(dòng)，使滯留體積中的懸浮液保持均勻并防止其堵塞管道（圖 2）。  
   
材料和方法
通過 TEMPEST 或 Multidrop Combi，我們將 SNU-1 細(xì)胞接種在 1536 孔板（Corning #3893）中的 5 μL 培養(yǎng)基中。將板在 37°C、98% 相對(duì)濕度和 5% CO2 條件下培養(yǎng)長達(dá) 72 小時(shí)。 對(duì)于 CTG 測定 (Promega)，我們在每孔中加入 1 μL 的 CTG，使用與細(xì)胞接種相同的儀器。 我們研究了兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)：1) 時(shí)間 = 0（將細(xì)胞添加到微孔板后一小時(shí)內(nèi)）和 2) 時(shí)間 = 72 小時(shí)。 在時(shí)間 = 0 時(shí)，我們使用新鮮的 CTG。在時(shí)間 = 72 小時(shí)時(shí)，我們進(jìn)行了兩個(gè)實(shí)驗(yàn)：1) 使用新鮮的 CTG，和 2) 使用留在已充注儀器上過夜（16 小時(shí)）的 CTG。 我們使用 Envision (PerkinElmer) 對(duì)微孔板成像，并用 ActivityBase (IDBS) 分析細(xì)胞代謝活性。
 
結(jié)果和討論
根據(jù)我們的經(jīng)驗(yàn)，Multidrop Combi 能夠在日常操作中始終如一地提供準(zhǔn)確和精確的分液，其中能對(duì)大量微孔板進(jìn)行快速連續(xù)分液。我們以使用新鮮 CTG 的時(shí)間 = 0 點(diǎn)為例說明了該觀察結(jié)果（圖 2，左）。另一方面，使用 TEMPEST 進(jìn)行的檢測表現(xiàn)出略低的離散度，其中高于零抑制的孔較少（圖 2，右）。這可能是由于微隔膜分液技術(shù)比蠕動(dòng)技術(shù)京都更高。
   
在時(shí)間 = 72 小時(shí)使用新鮮 CTG 進(jìn)行的細(xì)胞活性測定中，使用 Multidrop Combi 的效果還是和預(yù)期一樣。 Multidrop Combi（圖 3，左）和 TEMPEST（圖 3，左）的信號(hào)背景比 (S/B) 相當(dāng)，分別計(jì)算為 345 和 408。 相似的 S/B 比率表明平板上的細(xì)胞處于相同的代謝活動(dòng)水平，表明這兩種儀器對(duì)長期細(xì)胞活性具有相同影響或是沒有影響。然而，兩種儀器之間的數(shù)據(jù)離散度差異甚至比時(shí)間 = 0 時(shí)更大，TEMPEST 的 Z' = 0.7，而 Multidrop Combi 的 Z' = 0.56，這正好解釋了使用 TEMPEST 進(jìn)行分析時(shí)信號(hào)背景比和前者相比高約 18% 。
   
當(dāng) CTG 保留在儀器上過夜時(shí)，情況發(fā)生了巨大變化。 Multidrop Combi 管道堵塞，無法獲得數(shù)據(jù)，而 TEMPEST 的再循環(huán)功能則完全避免了這一情況。此外，使用 TEMPEST 處理新鮮 CTG 的產(chǎn)生的數(shù)據(jù)（圖 3，左）與使用過夜 CTG （圖 3，右）獲得的數(shù)據(jù)幾乎沒有區(qū)別。這種一致性令人驚訝，因?yàn)楦鶕?jù)制造商的說法，重構(gòu)的 CTG 試劑可以在室溫下儲(chǔ)存長達(dá)八小時(shí)，以將活性損失保持在 10% 以下。一種可能的解釋是通過再循環(huán)頻繁混合可延長 CTG 試劑的半衰期。
   
結(jié)論
我們通過 TEMPEST 或 Multidrop Combi 分液器實(shí)施 CellTiter-Glo 測定法對(duì)細(xì)胞活性進(jìn)行研究。兩種儀器之間的數(shù)據(jù)具有可比性，但是使用 TEMPEST 進(jìn)行分液的試驗(yàn)從時(shí)間 = 0 開始始終具有較低的離散度。時(shí)間 = 72 小時(shí)使用 TEMPEST 分配新鮮 CTG 的試驗(yàn)有著更高的 Z` 和高約 18% 信號(hào)背景比。 當(dāng) CTG 在儀器上放置過夜時(shí)，它會(huì)堵塞 Multidrop Combi 管道，因此無法獲得數(shù)據(jù)。然而，TEMPEST 的再循環(huán)功能可防止 CTG 在一夜之間變干并堵塞芯片，生成的數(shù)據(jù)幾乎與使用新鮮 CTG 獲得的數(shù)據(jù)相同。
 
總體而言，具有再循環(huán)功能的 TEMPEST 非常適合高通量全自動(dòng) CTG 分析，無需在機(jī)器待機(jī)期間進(jìn)行人為處理。這些觀察結(jié)果表明，Tempest 的使用可以更廣泛地?cái)U(kuò)展到涉及分配沉淀懸浮液、需要穩(wěn)定的非環(huán)境溫度的試劑以及干燥時(shí)會(huì)堵塞的高濃度溶液的工作流程。該研究還表明，TEMPEST 的分液足夠溫和，可用于分配細(xì)胞懸液。
 
致謝
這項(xiàng)研究是與 Forma Therapeutics 合作進(jìn)行的。 Forma 現(xiàn)在是 Novo Nordisk 的一部分，是一家臨床階段的生物制藥公司，專注于新療法的開發(fā)和商業(yè)化，以改變罕見血液病和癌癥患者的生活。他們藥物研發(fā)的專業(yè)知識(shí)創(chuàng)造了一系列小分子候選產(chǎn)品，專注于未滿足患者需求的適應(yīng)癥。