NK試劑盒使用注意事項(xiàng)及NK細(xì)胞培養(yǎng)攻略
NK細(xì)胞
自然殺傷細(xì)胞（Natural killer cell，NK細(xì)胞 )，是除T細(xì)胞、B細(xì)胞之外的第三大類淋巴細(xì)胞，不表達(dá)T細(xì)胞和B細(xì)胞所特有的膜表面分子。無需抗原的預(yù)先刺激與活化即可直接殺傷被病毒感染的自身細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞，與抗腫瘤、抗感染和免疫調(diào)節(jié)有關(guān)，是固有免疫最重要的組成成分之一。
NK細(xì)胞大概約占外周血淋巴細(xì)胞的10％—15％，主要源于骨髓中的造血干細(xì)胞，由NK前體細(xì)胞發(fā)育分化而來，是腫瘤免疫微環(huán)境中的重要效應(yīng)細(xì)胞。人NK細(xì)胞可根據(jù)其表面標(biāo)志物CD56的表達(dá)分為兩類：CD56dim和CD56bright，其中CD56dimNK細(xì)胞主要存在于外周血中，可表達(dá)顆粒酶、穿孔素直接殺傷腫瘤細(xì)胞，CD56brightNK細(xì)胞主要存在于淋巴器官中，不表達(dá)穿孔素，產(chǎn)生大量的細(xì)胞因子，如γ干擾素，腫瘤壞死因子α，IL-12、IL-15和IL-18，具有重要的免疫調(diào)節(jié)功能。NK細(xì)胞是抗體依賴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用（ADCC）的主要效應(yīng)細(xì)胞，對(duì)清除腫瘤細(xì)胞、控制細(xì)菌和病毒感染具有重要作用。
用于腫瘤免疫治療的NK細(xì)胞策略有：體外活化的自體或異體NK細(xì)胞治療；聯(lián)合NK細(xì)胞和單抗藥（如免疫檢查點(diǎn)抑制劑）來誘導(dǎo)抗體特異的細(xì)胞毒性；構(gòu)建CAR-NK細(xì)胞免疫療法等，這種細(xì)胞療法的治療關(guān)鍵，在于產(chǎn)生數(shù)量足夠的、能夠識(shí)別并殺傷腫瘤的免疫細(xì)胞以及效應(yīng)細(xì)胞。它們?cè)诘竭_(dá)腫瘤所在的部位后能夠被激活，發(fā)揮抗腫瘤的作用；除此之外，還可以替代修補(bǔ)或者改善化療所引起的免疫功能受損。
目前體外NK培養(yǎng)技術(shù)目前已經(jīng)很成熟，針對(duì)于我司的NK細(xì)胞培養(yǎng)試劑盒，現(xiàn)歸納整理了試劑盒使用注意事項(xiàng)及攻略，方便老師們?cè)贜K培養(yǎng)時(shí)查閱。
首先在開始實(shí)驗(yàn)之前，我們要確認(rèn)一下所需物料是否充足、設(shè)備是否都正常運(yùn)行，如果均正常的話就可以進(jìn)行接下來的試驗(yàn)了，在這里小編整理了一些關(guān)于NK細(xì)胞培養(yǎng)的攻略，主要涉及到物料的使用及操作方法等。
01
培養(yǎng)基的使用
① 每次補(bǔ)液前需要將培養(yǎng)基在室溫下自然復(fù)溫。
② 禁止將整瓶培養(yǎng)基放入37℃孵箱復(fù)溫，否則會(huì)加速補(bǔ)液培養(yǎng)基中細(xì)胞因子的失活。
③ 配置好的擴(kuò)增培養(yǎng)基（含IL-2）時(shí)效較短，超過一周不建議使用，尤其是活化前期（前7天）。
02
正確處理和保存血漿：具體見說明書。滅活離心后的血漿要確保澄清，添加血漿時(shí)需考慮抗凝劑對(duì)血漿的稀釋作用。
03
培養(yǎng)袋的使用：培養(yǎng)體積小于1L的時(shí)候，需要折疊培養(yǎng)袋再進(jìn)行放置。建議使用我司推薦型號(hào)。
04
靈活掌握補(bǔ)液時(shí)機(jī)：細(xì)胞擴(kuò)增狀態(tài)不理想時(shí)，前期補(bǔ)液可推遲補(bǔ)液時(shí)間，不要調(diào)整補(bǔ)液的體積尤其注意第一次補(bǔ)液的時(shí)機(jī)。裝袋后的補(bǔ)液體積和補(bǔ)液時(shí)間可根據(jù)細(xì)胞狀態(tài)進(jìn)行調(diào)整。
05
控制細(xì)胞結(jié)團(tuán)：細(xì)胞裝袋前，需要根據(jù)克隆團(tuán)的情況充分拍散細(xì)胞。裝袋后也需每天對(duì)袋子進(jìn)行拍打，揉搓肉眼觀察較大的細(xì)胞團(tuán)。
06
培養(yǎng)初期不要隨意晃動(dòng)培養(yǎng)瓶：否則活化的克隆團(tuán)容易飄起來，而降低包被因子對(duì)細(xì)胞團(tuán)的活化。
07
分離PBMC:推薦用進(jìn)口淋巴細(xì)胞分離液
①最高的得率和細(xì)胞活性
②減少血小板和細(xì)胞碎片的殘留（太多影響NK細(xì)胞貼壁，進(jìn)而影響活化）
③種瓶密度：PBMC鋪瓶的起始細(xì)胞密度建議2×106個(gè)/mL，臍血初始NK比例較低時(shí)，可適當(dāng)提高初始鋪瓶細(xì)胞密度至3-4×106個(gè)/mL。
08
細(xì)胞鋪瓶（推薦用電動(dòng)移液器打到非包被接觸的瓶底）
①分離的PBMC用生理鹽水洗滌2次重懸于25ml培養(yǎng)基（保證細(xì)胞分散）
②電動(dòng)移液器打到非包被接觸的瓶底，輕輕擺動(dòng)瓶子鋪勻即可，時(shí)間盡量短
09
設(shè)備保養(yǎng)：定期檢查CO2培養(yǎng)箱溫度、濃度并及時(shí)更換濾網(wǎng)。定期保養(yǎng)和清潔生物安全柜。
10
環(huán)境監(jiān)測(cè)：定期更換初效、中效、高效過濾器，保證潔凈區(qū)環(huán)境標(biāo)準(zhǔn)。
11
固定實(shí)驗(yàn)耗材種類和型號(hào)：需提前評(píng)估變更型號(hào)、規(guī)格對(duì)培養(yǎng)效果的影響，如175的培養(yǎng)瓶，細(xì)胞培養(yǎng)袋。
同立海源AMMS®NK細(xì)胞培養(yǎng)試劑盒套裝組分均采用公司自產(chǎn)的GMP級(jí)細(xì)胞因子制備，并采用進(jìn)口藥用包材在GMP制藥環(huán)境生產(chǎn)，適用于自體外周血或臍血細(xì)胞中分離得到的單個(gè)核細(xì)胞體外擴(kuò)增培養(yǎng)。另外該試劑盒已通過美國(guó)FDA 的 DMF II類備案（035588），不僅滿足客戶對(duì)高純度、高活率的NK細(xì)胞需求，并且滿足CAR-NK細(xì)胞藥物臨床實(shí)驗(yàn)要求。
DMF備案
035588
自然殺傷細(xì)胞（Natural killer cell，NK細(xì)胞 )，是除T細(xì)胞、B細(xì)胞之外的第三大類淋巴細(xì)胞，不表達(dá)T細(xì)胞和B細(xì)胞所特有的膜表面分子。無需抗原的預(yù)先刺激與活化即可直接殺傷被病毒感染的自身細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞，與抗腫瘤、抗感染和免疫調(diào)節(jié)有關(guān)，是固有免疫最重要的組成成分之一。
NK細(xì)胞大概約占外周血淋巴細(xì)胞的10％—15％，主要源于骨髓中的造血干細(xì)胞，由NK前體細(xì)胞發(fā)育分化而來，是腫瘤免疫微環(huán)境中的重要效應(yīng)細(xì)胞。人NK細(xì)胞可根據(jù)其表面標(biāo)志物CD56的表達(dá)分為兩類：CD56dim和CD56bright，其中CD56dimNK細(xì)胞主要存在于外周血中，可表達(dá)顆粒酶、穿孔素直接殺傷腫瘤細(xì)胞，CD56brightNK細(xì)胞主要存在于淋巴器官中，不表達(dá)穿孔素，產(chǎn)生大量的細(xì)胞因子，如γ干擾素，腫瘤壞死因子α，IL-12、IL-15和IL-18，具有重要的免疫調(diào)節(jié)功能。NK細(xì)胞是抗體依賴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用（ADCC）的主要效應(yīng)細(xì)胞，對(duì)清除腫瘤細(xì)胞、控制細(xì)菌和病毒感染具有重要作用。
用于腫瘤免疫治療的NK細(xì)胞策略有：體外活化的自體或異體NK細(xì)胞治療；聯(lián)合NK細(xì)胞和單抗藥（如免疫檢查點(diǎn)抑制劑）來誘導(dǎo)抗體特異的細(xì)胞毒性；構(gòu)建CAR-NK細(xì)胞免疫療法等，這種細(xì)胞療法的治療關(guān)鍵，在于產(chǎn)生數(shù)量足夠的、能夠識(shí)別并殺傷腫瘤的免疫細(xì)胞以及效應(yīng)細(xì)胞。它們?cè)诘竭_(dá)腫瘤所在的部位后能夠被激活，發(fā)揮抗腫瘤的作用；除此之外，還可以替代修補(bǔ)或者改善化療所引起的免疫功能受損。
目前體外NK培養(yǎng)技術(shù)目前已經(jīng)很成熟，針對(duì)于我司的NK細(xì)胞培養(yǎng)試劑盒，現(xiàn)歸納整理了試劑盒使用注意事項(xiàng)及攻略，方便老師們?cè)贜K培養(yǎng)時(shí)查閱。
首先在開始實(shí)驗(yàn)之前，我們要確認(rèn)一下所需物料是否充足、設(shè)備是否都正常運(yùn)行，如果均正常的話就可以進(jìn)行接下來的試驗(yàn)了，在這里小編整理了一些關(guān)于NK細(xì)胞培養(yǎng)的攻略，主要涉及到物料的使用及操作方法等。
01
培養(yǎng)基的使用
① 每次補(bǔ)液前需要將培養(yǎng)基在室溫下自然復(fù)溫。
② 禁止將整瓶培養(yǎng)基放入37℃孵箱復(fù)溫，否則會(huì)加速補(bǔ)液培養(yǎng)基中細(xì)胞因子的失活。
③ 配置好的擴(kuò)增培養(yǎng)基（含IL-2）時(shí)效較短，超過一周不建議使用，尤其是活化前期（前7天）。
02
正確處理和保存血漿：具體見說明書。滅活離心后的血漿要確保澄清，添加血漿時(shí)需考慮抗凝劑對(duì)血漿的稀釋作用。
03
培養(yǎng)袋的使用：培養(yǎng)體積小于1L的時(shí)候，需要折疊培養(yǎng)袋再進(jìn)行放置。建議使用我司推薦型號(hào)。
04
靈活掌握補(bǔ)液時(shí)機(jī)：細(xì)胞擴(kuò)增狀態(tài)不理想時(shí)，前期補(bǔ)液可推遲補(bǔ)液時(shí)間，不要調(diào)整補(bǔ)液的體積尤其注意第一次補(bǔ)液的時(shí)機(jī)。裝袋后的補(bǔ)液體積和補(bǔ)液時(shí)間可根據(jù)細(xì)胞狀態(tài)進(jìn)行調(diào)整。
05
控制細(xì)胞結(jié)團(tuán)：細(xì)胞裝袋前，需要根據(jù)克隆團(tuán)的情況充分拍散細(xì)胞。裝袋后也需每天對(duì)袋子進(jìn)行拍打，揉搓肉眼觀察較大的細(xì)胞團(tuán)。
06
培養(yǎng)初期不要隨意晃動(dòng)培養(yǎng)瓶：否則活化的克隆團(tuán)容易飄起來，而降低包被因子對(duì)細(xì)胞團(tuán)的活化。
07
分離PBMC:推薦用進(jìn)口淋巴細(xì)胞分離液
①最高的得率和細(xì)胞活性
②減少血小板和細(xì)胞碎片的殘留（太多影響NK細(xì)胞貼壁，進(jìn)而影響活化）
③種瓶密度：PBMC鋪瓶的起始細(xì)胞密度建議2×106個(gè)/mL，臍血初始NK比例較低時(shí)，可適當(dāng)提高初始鋪瓶細(xì)胞密度至3-4×106個(gè)/mL。
08
細(xì)胞鋪瓶（推薦用電動(dòng)移液器打到非包被接觸的瓶底）
①分離的PBMC用生理鹽水洗滌2次重懸于25ml培養(yǎng)基（保證細(xì)胞分散）
②電動(dòng)移液器打到非包被接觸的瓶底，輕輕擺動(dòng)瓶子鋪勻即可，時(shí)間盡量短
09
設(shè)備保養(yǎng)：定期檢查CO2培養(yǎng)箱溫度、濃度并及時(shí)更換濾網(wǎng)。定期保養(yǎng)和清潔生物安全柜。
10
環(huán)境監(jiān)測(cè)：定期更換初效、中效、高效過濾器，保證潔凈區(qū)環(huán)境標(biāo)準(zhǔn)。
11
固定實(shí)驗(yàn)耗材種類和型號(hào)：需提前評(píng)估變更型號(hào)、規(guī)格對(duì)培養(yǎng)效果的影響，如175的培養(yǎng)瓶，細(xì)胞培養(yǎng)袋。
同立海源AMMS®NK細(xì)胞培養(yǎng)試劑盒套裝組分均采用公司自產(chǎn)的GMP級(jí)細(xì)胞因子制備，并采用進(jìn)口藥用包材在GMP制藥環(huán)境生產(chǎn)，適用于自體外周血或臍血細(xì)胞中分離得到的單個(gè)核細(xì)胞體外擴(kuò)增培養(yǎng)。另外該試劑盒已通過美國(guó)FDA 的 DMF II類備案（035588），不僅滿足客戶對(duì)高純度、高活率的NK細(xì)胞需求，并且滿足CAR-NK細(xì)胞藥物臨床實(shí)驗(yàn)要求。
DMF備案
035588
——NK、CAR-NK細(xì)胞藥物臨床實(shí)驗(yàn)的選擇！
NK總細(xì)胞擴(kuò)增變化
NK細(xì)胞擴(kuò)增比例
PBMC培養(yǎng)流式結(jié)果
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