染色質免疫共沉淀技術的原理是在活細胞狀態(tài)下固定蛋白質－DNA復合物，并將其隨機切斷為一定長度范圍內的染色質小片段，然后通過免疫學方法沉淀此復合體，特異性地富集目的蛋白結合的DNA片段，通過對目的片斷的純化與檢測，從而獲得蛋白質與DNA相互作用的信息。

 

一、細胞交聯(lián)與裂解

在裝有20ml生長培養(yǎng)基的150mm培養(yǎng)皿中培養(yǎng)貼壁細胞，長到80%-90%密度，約107個細胞。如有必要，可進行刺激或處理。建議采用1×106個細胞作為一次ChIP的細胞量。

 

 1）在20ml培養(yǎng)基中加入終濃度為1%的甲醛，輕輕渦旋培養(yǎng)皿混勻，使細胞在甲醛中固定，室溫固定10分鐘（對于轉錄因子和轉錄輔因子，可適當延長交聯(lián)時間，但不超過30分鐘）。加入甲醛后培養(yǎng)基的顏色會發(fā)生改變；

2）在培養(yǎng)皿中加入濃度為0.125M的甘氨酸，輕輕渦旋混勻，室溫反應5分鐘，淬滅未反應的甲醛，終止交聯(lián)。加入甘氨酸后培養(yǎng)基的顏色會發(fā)生改變；

3）棄培養(yǎng)基，20ml預冷的1×PBS洗滌細胞，重復洗滌一次；

4）在培養(yǎng)皿中加入2ml 預冷的含蛋白酶抑制劑混合物的1×PBS；使用細胞刮收集細胞，4°C，800g，離心5分鐘；

5）去除上清液（此步細胞可在液氮中快速冷卻，存放于-80°C保存幾個月），細胞再次重懸于0.5ml含蛋白酶抑制劑混合物的細胞裂解緩沖液中，冰上孵育15分鐘，每5分鐘渦旋一次；

6）4°C，800g，離心5分鐘。小心去除上清液，加入0.5ml含蛋白酶抑制劑混合物的細胞核裂解緩沖液，使其重懸。

二、超聲處理片段化 DNA

超聲處理的效果取決于細胞類型、細胞濃度和儀器。需要通過預實驗確定超聲的最佳條件，以便將交聯(lián)DNA剪切為如上圖的約200-1000bp長度。染色質片段化對于ChIP實驗成功很關鍵。片段化不足會導致樣本丟失，片段化過度會破壞靶標蛋白表位、降低ChIP效率。在超聲過程中，保持樣品一直處于冰上低溫狀態(tài)。不要使探頭接觸超聲管底部或管壁，如超聲過程產生泡沫，需暫停超聲并調整超聲管位置。

 

超聲處理后，4°C，12000g離心10分鐘。離心后，留取5μl染色質溶液進行瓊脂糖凝膠分析，以檢測超聲效率�？蓪⒊�聲前和超聲后各取的5μl染色質溶液對比分析。

圖1 超聲前超聲后

 

三、靶蛋白和DNA 免疫共沉淀

將下述緩沖液放于冰上保存：低鹽洗滌緩沖液高鹽洗滌緩沖液，LiCl洗滌緩沖液和TE洗滌緩沖液。配制450μl稀釋緩沖液（含蛋白酶抑制劑混合物），冰上保存。如有多個樣品可合并配制。

 

1）取上述50μl離心后的裂解液上清加入到新的離心管中，作為一次免疫沉淀實驗的DNA混合物樣本。每50μl 裂解液中含有1×106個細胞裂解產物。ChIP反應包括陽性對照抗體管、陰性對照IgG管和目的蛋白抗體管。推薦陰性對照IgG和目的抗體使用同一物種來源。

2）在上述50μl片段化染色質樣品的離心管中加入上述配制好的450μl 稀釋緩沖液，充分混勻。每管取 5μl 樣品于新的離心管中作為實驗的1% “input”，用于實驗的優(yōu)化與數據處理，保存于4°C，直至蛋白DNA復合物洗脫與解交聯(lián)步驟。

3）取完inpμt的離心管中分別加入1-10μg免疫沉淀抗體，4°C轉子上孵育4h以上或過夜。

4）每個離心管中加入20μl蛋白A/G磁珠（建議將吸頭前端剪去一小部分后再吸取磁珠），4°C 轉子上孵育2h。

5）磁力架吸附，靜置1-2分鐘，去上清。按如下步驟洗滌蛋白A/G磁珠-抗體-蛋白/DNA復合物：

低鹽洗滌緩沖液，4°C轉子上孵育3-5分鐘，洗滌一次；

高鹽洗滌緩沖液，4°C轉子上孵育3-5分鐘，洗滌一次；

LiCl 洗滌緩沖液，4°C轉子上孵育3-5分鐘，洗滌一次；

 

注：使用前將等體積A液及B液混勻，請勿提前混勻，否則會導致出現(xiàn)沉淀析出。TE 緩沖液，4°C轉子上孵育 3-5 分鐘，洗滌一次。

圖2 靶蛋白和DNA免疫共沉淀示意圖

四、洗脫和解交聯(lián)

實驗前準備：解凍蛋白酶K；ChIP洗脫緩沖液恢復至室溫，以確保SDS溶解；配制洗脫緩沖液；ChIP洗脫緩沖液100μl+蛋白酶K 1μl（多個樣本可合并配制）。

1）樣品管及Input管加入ChIP洗脫緩沖液（含蛋白酶K）；

2）62°C孵育2小時；

3）在95°C下培養(yǎng)10分鐘；

4）讓樣品冷卻至室溫；

5）10000g離心10秒收集管蓋及管壁上殘留樣品，采用磁力架分離磁珠。將上清液小心轉移至一個新的試管中。

 

五、DNA 純化

采用純化柱進行DNA純化（免疫沉淀和input）。

 

六、鑒定分析

QPCR或者高通量測序的方法檢測IP得到的DNA。

 

七、常見問題

常見問題	常見原因/解決辦法
陰性對照（IgG IP）樣品的背景高	1、優(yōu)化抗體的濃度，過量抗體導致非靶點的結合； 2、與微珠的非特異結合：采用預純化步驟，以排除這些非靶點，或加入微珠的封閉劑； 3、染色質的不完全斷裂：優(yōu)化斷裂過程，以獲得長度在200-1000bp的染色質； 4、試劑被污染； 5、增加洗滌次數。
DNA 回收率低	1、ChIP 抗體失效或親和力低，使用 ChIP驗證過的抗體； 2、抗體使用量不足； 3、起始樣品不足，可適當增加起始樣品用量； 4、過度交聯(lián)或交聯(lián)不足； 5、磁珠與抗體的親和力低。
無法找到合適的ChIP抗體，該如何做ChIP實驗？	1、使用標簽抗體是一種解決抗體無法獲得、抗體可變性和交聯(lián)染色質的表位被遮蔽的方法。不過標簽有可能干擾轉錄因子的功能； 2、嘗試IP/IHC/IF抗體，效果需要自己摸索鑒定。
陰性對照抗體如何選擇？	使用與ChIP抗體相同物種的正常IgG，因此如果使用小鼠單克隆抗體，建議使用正常小鼠IgG。