PCR反應(yīng)污染原因追蹤及污染處理方法
PCR反應(yīng)的特點(diǎn)是具有較大擴(kuò)增能力與靈敏性，但令人頭痛的問題是易污染，極其微量的污染即可造成假陽性的產(chǎn)生。
一、污染原因：
1、標(biāo)本間交叉污染:標(biāo)本污染主要有收集標(biāo)本的容器被污染，或標(biāo)本放置時(shí)，由于密封不嚴(yán)溢于容器外，或容器外粘有標(biāo)本而造成相互間交叉污染;標(biāo)本核酸模板在提取過程中，由于吸樣槍污染導(dǎo)致標(biāo)本間污染;有些微生物標(biāo)本尤其是病毒可隨氣溶膠或形成氣溶膠而擴(kuò)散，導(dǎo)致彼此間的污染。
2、PCR試劑的污染: 主要是由于在PCR試劑配制過程中，由于加樣槍、容器、雙蒸水及其它溶液被PCR核酸模板污染。
3、PCR擴(kuò)增產(chǎn)物污染.這是PCR反應(yīng)中最主要的污染問題.因?yàn)镻CR產(chǎn)物拷貝量大(一般為1013拷貝/ml)，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于PCR檢測(cè)數(shù)個(gè)拷貝的極限，所以極微量的PCR產(chǎn)物污染，就可造成假陽就可形成假陽性。
還有一種容易忽視，最可能造成PCR產(chǎn)物污染的形式是氣溶膠污染；在空氣與液體面摩擦?xí)r就可形成氣溶膠，在操作時(shí)比較劇烈地?fù)u動(dòng)反應(yīng)管，開蓋時(shí)、吸樣時(shí)及污染進(jìn)樣槍的反復(fù)吸樣都可形成氣溶膠而污染.據(jù)計(jì)算一個(gè)氣溶膠顆�？珊�48000拷貝，因而由其造成的污染是一個(gè)值得特別重視的問題。
4、實(shí)驗(yàn)室中克隆質(zhì)粒的污染:在分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室及某些用克隆質(zhì)粒做陽性對(duì)照的檢驗(yàn)室，這個(gè)問題也比較常見.因?yàn)榭寺≠|(zhì)粒在單位容積內(nèi)含量相當(dāng)高，另外在純化過程中需用較多的用具及試劑，而且在活細(xì)胞內(nèi)的質(zhì)粒，由于活細(xì)胞的生長(zhǎng)繁殖的簡(jiǎn)便性及具有很強(qiáng)的生命力.其污染可能性也很大。
污染的監(jiān)測(cè)：一個(gè)好的實(shí)驗(yàn)室，要時(shí)刻注意污染的監(jiān)測(cè)，考慮有無污染是什么原因造成的污染，以 便采取措施，防止和消除污染。
二、污染處理：
1.環(huán)境污染
(1)稀酸處理法：對(duì)可疑器具用1mol/L鹽酸擦拭或浸泡，使殘余DNA脫嘌呤。
(2)紫外照射（UV）法：紫外波長(zhǎng)（nm）一般選擇254/300nm,照射30min即可。需要注意的是，選擇UV作為消除殘留PCR產(chǎn)物污染時(shí)，要考慮PCR產(chǎn)物的長(zhǎng)度與產(chǎn)物序列中堿基的分布，UV照射僅對(duì)500bp以上長(zhǎng)片段有效，對(duì)短片段效果不大。UV照射時(shí)，PCR產(chǎn)物中嘧啶堿基會(huì)形成二聚體，這些二聚體可使延伸終止，但并不是DNA鏈中所有嘧啶均能形成二聚體，且UV照射還可使二聚體斷裂。形成二聚體的程度取決于UV波長(zhǎng)，嘧啶二聚體的類型及與二聚體位點(diǎn)相鄰核苷酸的序列。在受照射的長(zhǎng)DNA鏈上，形成二聚體缺陷的數(shù)量少于0.065/堿基，其他非二聚體的光照損傷（如環(huán)丁烷型嘧啶復(fù)合體，胸腺嘧啶乙二醇，DNA鏈間與鏈內(nèi)的交聯(lián)和DNA斷裂等）均可終止Taq DNA聚合酶的延伸。這些位點(diǎn)的數(shù)量與二聚體位點(diǎn)相當(dāng)。如果這些位點(diǎn)（0.13/堿基）在DNA分子上隨機(jī)分布，一個(gè)500bp片段的DNA分子鏈上將有32處損傷位點(diǎn)，那么，105個(gè)這樣的分子中每個(gè)分子中會(huì)至少有一處損傷。相反，如果100bp的片段，每條鏈上僅有6處損傷，105個(gè)拷貝分子中將有許多分子沒有任何損傷。這就是UV照射有一定的片段長(zhǎng)度限制的原因。
2.反應(yīng)液污染
可采用下列方法之一處理：
(1)DNase I法：PCR混合液（未加模板和Taq聚合酶）加入0.5U DNase I,室溫反應(yīng)30 min后加熱滅活，然后加入模板和Taq聚合酶進(jìn)行正常PCR擴(kuò)增。該方法的優(yōu)點(diǎn)是不需要知道污染DNA的序列。
(2)內(nèi)切酶法：選擇識(shí)別4個(gè)堿基的內(nèi)切酶（如Msp I和Taq I等），可同時(shí)選擇幾種，以克服用一種酶只能識(shí)別特定序列的缺陷，室溫作用1h 后加熱滅活進(jìn)行PCR。
(3)紫外照射法：未加模板和Taq聚合酶的PCR混合液進(jìn)行紫外照射，注意事項(xiàng)與方法同上述UV照射法。
(4)g射線輻射法：1.5kGy的輻射可完全破壞0.1ng基因組DNA,2.0 kGy可破壞104拷貝的質(zhì)粒分子，4.0 kGy仍不影響PCR,但高于此限度會(huì)使PCR擴(kuò)增效率下降。引物可受照射而不影響PCR,g射線是通過水的離子化產(chǎn)生自由基來破壞DNA的。
3.尿嘧啶糖苷酶（UNG）法
由于UV照射的去污染作用對(duì)500bp以下的片段效果不好，而臨床用于檢測(cè)的PCR擴(kuò)增片段通常為300bp左右，因此UNG的預(yù)防作用日益受到重視和肯定。
(1)原理：在PCR產(chǎn)物或引物中用dU 代替dT.這種dU化的PCR產(chǎn)物與UNG一起孵育，因UDG可裂解尿嘧啶堿基和糖磷酸骨架間的N-糖基鍵，可除去dU而阻止TaqDNA聚合酶的延伸，從而失去被再擴(kuò)增的能力。UNG對(duì)不含dU的模板無任何影響。UNG可從單或雙鏈DNA中消除尿嘧啶，而對(duì)RNA中的尿嘧啶和單一尿嘧啶分子則無任何作用。
(2)dUTP法：用dUTP代替dTTP,使產(chǎn)物中摻入大量dU.在再次進(jìn)行PCR擴(kuò)增前，用UNG處理PCR混合液即可消除PCR產(chǎn)物的殘留污染。由于UNG在PCR循環(huán)中的變性一步便可被滅活，因此不會(huì)影響含dU的新的PCR產(chǎn)物。
(3)dU引物法：合成引物時(shí)以dU 代dT,這樣PCR產(chǎn)物中僅5ˊ端帶dU.UNG處理后，引物失去了結(jié)合位點(diǎn)而不能擴(kuò)增。對(duì)長(zhǎng)片段（1-2kb以上）的擴(kuò)增用dUTP法效率較用dTTP低，而用dU法就可克服這一缺點(diǎn)。dU引物最好將dU設(shè)計(jì)在3ˊ端或近ˊ端。該法僅能用于引物以外試劑的處理。
(4)優(yōu)點(diǎn)：可以去除任何來源的污染；UNG處理可以和PCR擴(kuò)增在同一個(gè)反應(yīng)管內(nèi)進(jìn)行；由于擴(kuò)增產(chǎn)物中有大量dU存在，可徹底消除污染源。
(5)需注意的是摻入dUTP的DNA不應(yīng)對(duì)產(chǎn)物的任何操作有影響，在進(jìn)行PCR產(chǎn)物克隆時(shí)，應(yīng)該轉(zhuǎn)化UNG-（UNG缺陷）大腸桿菌受體菌，否則轉(zhuǎn)化產(chǎn)物會(huì)被受體菌UNG消化掉。
4. 固相捕獲法
用于去除標(biāo)本中污染的核酸和雜質(zhì)，原理如下：
(1）用一生物素標(biāo)記的單鏈RNA探針與待擴(kuò)核酸雜交，雜交區(qū)域是非擴(kuò)增區(qū)。
(2）用包被鏈霉親和素的固相載體來捕獲帶有生物素探針的雜交核酸，通過漂洗可去除污染的擴(kuò)增產(chǎn)物和雜質(zhì)。
(3）洗脫靶分子后用特異引物擴(kuò)增非RNA探針雜交區(qū)域。第(2)步的漂洗后可用PCR檢測(cè)以確定標(biāo)本是否被擴(kuò)增產(chǎn)物或重組質(zhì)粒污染。
5.RS-PCR法（RNA-specific PCR）
也稱為鏈特異性PCR,主要指用于RNA模板的特異性PCR法，該法可明顯降低假陽性而不影響PCR的敏感性。其關(guān)鍵在于設(shè)計(jì)引物，逆轉(zhuǎn)錄引物的3ˊ端(A區(qū))有2 0個(gè)核苷酸左右為模板的特異性互不序列，5ˊ端2 0個(gè)核苷酸(C區(qū))為附加修飾堿基。與mRNA逆轉(zhuǎn)錄后，經(jīng)超速離心使 cDNA與多余引物分開，再用和第二引物(C)以第一鏈cDNA為模板合成第二鏈cDNA,以后的PCR循環(huán)中用逆轉(zhuǎn)錄引物的B區(qū)和引物C進(jìn)行擴(kuò)增加尾cDNA,而污染的DNA或質(zhì)粒DNA才不會(huì)被擴(kuò)增。
6.抗污染引物法
該對(duì)引物擴(kuò)增時(shí)通過病毒DNA克隆如入質(zhì)粒的位點(diǎn)。這一區(qū)域只存在完整的原病毒中，在重組質(zhì)粒中，這一區(qū)域分成兩個(gè)區(qū)域與克隆位點(diǎn)被。如果重組質(zhì)粒污染了標(biāo)本，也不能擴(kuò)增出任何條帶，即使出現(xiàn)了擴(kuò)增帶，其大小也與預(yù)期的不同。只有原病毒DNA才能被引物擴(kuò)增，因此只要出現(xiàn)預(yù)期大小的擴(kuò)增帶就可以證明標(biāo)本是陽性的，該法試用于環(huán)狀靶分子系列。
二、污染處理：
1.環(huán)境污染
(1)稀酸處理法：對(duì)可疑器具用1mol/L鹽酸擦拭或浸泡，使殘余DNA脫嘌呤。
(2)紫外照射（UV）法：紫外波長(zhǎng)（nm）一般選擇254/300nm,照射30min即可。需要注意的是，選擇UV作為消除殘留PCR產(chǎn)物污染時(shí)，要考慮PCR產(chǎn)物的長(zhǎng)度與產(chǎn)物序列中堿基的分布，UV照射僅對(duì)500bp以上長(zhǎng)片段有效，對(duì)短片段效果不大。UV照射時(shí)，PCR產(chǎn)物中嘧啶堿基會(huì)形成二聚體，這些二聚體可使延伸終止，但并不是DNA鏈中所有嘧啶均能形成二聚體，且UV照射還可使二聚體斷裂。形成二聚體的程度取決于UV波長(zhǎng)，嘧啶二聚體的類型及與二聚體位點(diǎn)相鄰核苷酸的序列。在受照射的長(zhǎng)DNA鏈上，形成二聚體缺陷的數(shù)量少于0.065/堿基，其他非二聚體的光照損傷（如環(huán)丁烷型嘧啶復(fù)合體，胸腺嘧啶乙二醇，DNA鏈間與鏈內(nèi)的交聯(lián)和DNA斷裂等）均可終止Taq DNA聚合酶的延伸。這些位點(diǎn)的數(shù)量與二聚體位點(diǎn)相當(dāng)。如果這些位點(diǎn)（0.13/堿基）在DNA分子上隨機(jī)分布，一個(gè)500bp片段的DNA分子鏈上將有32處損傷位點(diǎn)，那么，105個(gè)這樣的分子中每個(gè)分子中會(huì)至少有一處損傷。相反，如果100bp的片段，每條鏈上僅有6處損傷，105個(gè)拷貝分子中將有許多分子沒有任何損傷。這就是UV照射有一定的片段長(zhǎng)度限制的原因。
2.反應(yīng)液污染
可采用下列方法之一處理：
(1)DNase I法：PCR混合液（未加模板和Taq聚合酶）加入0.5U DNase I,室溫反應(yīng)30 min后加熱滅活，然后加入模板和Taq聚合酶進(jìn)行正常PCR擴(kuò)增。該方法的優(yōu)點(diǎn)是不需要知道污染DNA的序列。
(2)內(nèi)切酶法：選擇識(shí)別4個(gè)堿基的內(nèi)切酶（如Msp I和Taq I等），可同時(shí)選擇幾種，以克服用一種酶只能識(shí)別特定序列的缺陷，室溫作用1h 后加熱滅活進(jìn)行PCR。
(3)紫外照射法：未加模板和Taq聚合酶的PCR混合液進(jìn)行紫外照射，注意事項(xiàng)與方法同上述UV照射法。
(4)g射線輻射法：1.5kGy的輻射可完全破壞0.1ng基因組DNA,2.0 kGy可破壞104拷貝的質(zhì)粒分子，4.0 kGy仍不影響PCR,但高于此限度會(huì)使PCR擴(kuò)增效率下降。引物可受照射而不影響PCR,g射線是通過水的離子化產(chǎn)生自由基來破壞DNA的。
3.尿嘧啶糖苷酶（UNG）法
由于UV照射的去污染作用對(duì)500bp以下的片段效果不好，而臨床用于檢測(cè)的PCR擴(kuò)增片段通常為300bp左右，因此UNG的預(yù)防作用日益受到重視和肯定。
(1)原理：在PCR產(chǎn)物或引物中用dU 代替dT.這種dU化的PCR產(chǎn)物與UNG一起孵育，因UDG可裂解尿嘧啶堿基和糖磷酸骨架間的N-糖基鍵，可除去dU而阻止TaqDNA聚合酶的延伸，從而失去被再擴(kuò)增的能力。UNG對(duì)不含dU的模板無任何影響。UNG可從單或雙鏈DNA中消除尿嘧啶，而對(duì)RNA中的尿嘧啶和單一尿嘧啶分子則無任何作用。
(2)dUTP法：用dUTP代替dTTP,使產(chǎn)物中摻入大量dU.在再次進(jìn)行PCR擴(kuò)增前，用UNG處理PCR混合液即可消除PCR產(chǎn)物的殘留污染。由于UNG在PCR循環(huán)中的變性一步便可被滅活，因此不會(huì)影響含dU的新的PCR產(chǎn)物。
(3)dU引物法：合成引物時(shí)以dU 代dT,這樣PCR產(chǎn)物中僅5ˊ端帶dU.UNG處理后，引物失去了結(jié)合位點(diǎn)而不能擴(kuò)增。對(duì)長(zhǎng)片段（1-2kb以上）的擴(kuò)增用dUTP法效率較用dTTP低，而用dU法就可克服這一缺點(diǎn)。dU引物最好將dU設(shè)計(jì)在3ˊ端或近ˊ端。該法僅能用于引物以外試劑的處理。
(4)優(yōu)點(diǎn)：可以去除任何來源的污染；UNG處理可以和PCR擴(kuò)增在同一個(gè)反應(yīng)管內(nèi)進(jìn)行；由于擴(kuò)增產(chǎn)物中有大量dU存在，可徹底消除污染源。
(5)需注意的是摻入dUTP的DNA不應(yīng)對(duì)產(chǎn)物的任何操作有影響，在進(jìn)行PCR產(chǎn)物克隆時(shí)，應(yīng)該轉(zhuǎn)化UNG-（UNG缺陷）大腸桿菌受體菌，否則轉(zhuǎn)化產(chǎn)物會(huì)被受體菌UNG消化掉。
4. 固相捕獲法
用于去除標(biāo)本中污染的核酸和雜質(zhì)，原理如下：
(1）用一生物素標(biāo)記的單鏈RNA探針與待擴(kuò)核酸雜交，雜交區(qū)域是非擴(kuò)增區(qū)。
(2）用包被鏈霉親和素的固相載體來捕獲帶有生物素探針的雜交核酸，通過漂洗可去除污染的擴(kuò)增產(chǎn)物和雜質(zhì)。
(3）洗脫靶分子后用特異引物擴(kuò)增非RNA探針雜交區(qū)域。第(2)步的漂洗后可用PCR檢測(cè)以確定標(biāo)本是否被擴(kuò)增產(chǎn)物或重組質(zhì)粒污染。
5.RS-PCR法（RNA-specific PCR）
也稱為鏈特異性PCR,主要指用于RNA模板的特異性PCR法，該法可明顯降低假陽性而不影響PCR的敏感性。其關(guān)鍵在于設(shè)計(jì)引物，逆轉(zhuǎn)錄引物的3ˊ端(A區(qū))有2 0個(gè)核苷酸左右為模板的特異性互不序列，5ˊ端2 0個(gè)核苷酸(C區(qū))為附加修飾堿基。與mRNA逆轉(zhuǎn)錄后，經(jīng)超速離心使 cDNA與多余引物分開，再用和第二引物(C)以第一鏈cDNA為模板合成第二鏈cDNA,以后的PCR循環(huán)中用逆轉(zhuǎn)錄引物的B區(qū)和引物C進(jìn)行擴(kuò)增加尾cDNA,而污染的DNA或質(zhì)粒DNA才不會(huì)被擴(kuò)增。
6.抗污染引物法
該對(duì)引物擴(kuò)增時(shí)通過病毒DNA克隆如入質(zhì)粒的位點(diǎn)。這一區(qū)域只存在完整的原病毒中，在重組質(zhì)粒中，這一區(qū)域分成兩個(gè)區(qū)域與克隆位點(diǎn)被。如果重組質(zhì)粒污染了標(biāo)本，也不能擴(kuò)增出任何條帶，即使出現(xiàn)了擴(kuò)增帶，其大小也與預(yù)期的不同。只有原病毒DNA才能被引物擴(kuò)增，因此只要出現(xiàn)預(yù)期大小的擴(kuò)增帶就可以證明標(biāo)本是陽性的，該法試用于環(huán)狀靶分子系列。
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