類器官（Organoid）是一種在體外利用胚胎干細(xì)胞或者成體干細(xì)胞培養(yǎng)出的三維細(xì)胞培養(yǎng)物，它與人體器官具有相似的組織學(xué)特征。類器官最重要的特性是在體外培養(yǎng)環(huán)境中干細(xì)胞具有高度組織記憶和自我組裝能力，能夠自己長成類似于體內(nèi)組織的結(jié)構(gòu)，高度還原體內(nèi)器官的細(xì)胞構(gòu)成和功能。

近十年來，干細(xì)胞和3D細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的進(jìn)步重新點燃了人們對類器官研究的興趣。2013年，Science將類器官評為年度十大技術(shù)；2015年，MIT科技評論類器官為當(dāng)年十大科技突破之一；2017年，Nature Method將類器官評為年度最佳方法；2019年，新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志將類器官評為優(yōu)良的臨床前疾病模型。類器官來源于干細(xì)胞，如人類多能干細(xì)胞（hPSC）或干細(xì)胞/祖細(xì)胞，由能夠自組織的不同細(xì)胞類型組成，形成3D結(jié)構(gòu)，旨在成為器官的微型模擬物。研究探索并強(qiáng)調(diào)了類器官在模擬復(fù)雜的人類疾病、了解人類發(fā)育和再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的巨大潛力。實驗室中可以制造出類似于不同人體器官的各種類器官——腦、視網(wǎng)膜、胃、食道、肺、小腸、肝臟、胰腺、腎臟、血管等。

目前的類器官培養(yǎng)嚴(yán)重依賴動物來源的細(xì)胞外基質(zhì)（ECM），如Matrigel。然而，Matrigel的成分是不確定的，批次之間存在差異。這種ECM基質(zhì)的不一致極大地限制了當(dāng)前類器官模型的可重復(fù)性，并且不適合臨床應(yīng)用。此外，傳統(tǒng)的類器官培養(yǎng)方法通常從hPSC單層培養(yǎng)開始，其中單層hPSC以單細(xì)胞或小細(xì)胞簇的形式收獲，并在3D培養(yǎng)物中聚集。目前的類器官培養(yǎng)方法存在幾個關(guān)鍵的局限性：首先，動物源性基質(zhì)不穩(wěn)定，不適合臨床應(yīng)用。其次，使用傳統(tǒng)的2D單層培養(yǎng)方法從凍存復(fù)蘇的hPSCs通常會導(dǎo)致細(xì)胞活力低。接下來，將hPSC集落解離為單細(xì)胞是一種苛刻的技術(shù)，它將大大降低細(xì)胞活力，從而損害形成的hPSC聚集體的質(zhì)量。最后，這種傳統(tǒng)方法的可擴(kuò)展性有限。這是大規(guī)模、3D生產(chǎn)hPSC和類器官的主要障礙，這對于類器官作為臨床治療藥物的發(fā)展至關(guān)重要。因此，迫切需要一種方法，使得類器官分化容易且快捷，同時易于大規(guī)模生產(chǎn)，并保持細(xì)胞的高質(zhì)量。

一種無異源水凝膠可以很好地解決動物源基質(zhì)的問題，VitroGel STEM 和VitroGel ORGANOID從 hPSC 生成和培養(yǎng)中腸/后腸和類器官（圖 1）。
可以從單層hPSC甚至直接從凍存的hPSC快速輕松地生成3D hPSC球狀體，只需將這些細(xì)胞與VitroGel STEM混合即可（圖2）。在三天內(nèi)形成hPSC球狀體，可以使用相同的水凝膠3D培養(yǎng)系統(tǒng)分化為中腸/后腸，并進(jìn)一步用VitroGel ORGANOID生成類器官。
VitroGel STEM和VitroGel ORGANOID均不含異源成分，可提供強(qiáng)大的細(xì)胞擴(kuò)增和分化支撐。VitroGel可以克服當(dāng)前用于干細(xì)胞培養(yǎng)和類器官生成的ECM的缺點 ：

✦ VitroGel無異源而且穩(wěn)定，適用于下游臨床應(yīng)用；

✦ VitroGel STEM能夠提高液氮凍存hPSCs復(fù)蘇的細(xì)胞活力；

✦ VitroGel水凝膠具有高度可擴(kuò)展性，支持干細(xì)胞的大規(guī)模擴(kuò)增，甚至是類器官的生產(chǎn)。

VitroGel水凝膠可以提高生成的類器官的質(zhì)量和可重復(fù)性，以及干細(xì)胞的活力。


#  材料和方法  #

一、從凍存復(fù)蘇或2D培養(yǎng)的 hPSC 形成 3D 細(xì)胞球

VitroGel STEM能夠支持凍存hPSC復(fù)蘇培養(yǎng)和擴(kuò)增，形成3D hPSC細(xì)胞球狀體（圖3）。傳統(tǒng)方法需要在hPSC細(xì)胞復(fù)蘇和穩(wěn)定后，在基質(zhì)上多次傳代培養(yǎng)。在復(fù)蘇過程中，保持復(fù)蘇的hPSC的活力通常具有挑戰(zhàn)性。然而，VitroGel STEM消除這一困難，可以直接從液氮中取出細(xì)胞復(fù)蘇進(jìn)行培養(yǎng)，保持高的細(xì)胞活力，產(chǎn)生3D細(xì)胞球。
A、直接從儲存在液氮中的細(xì)胞形成的 hPSC 球狀體從第 1 天到第 6 天連續(xù)生長。B、堿性磷酸酶（AP）染色表明這些球狀體是健康的，hPSC活性高。

3D 細(xì)胞球形成：

1、將VitroGel STEM恢復(fù)至室溫或37°C。

2、細(xì)胞復(fù)蘇后，離心去除凍存液。

3、用 10 μM/mL ROCK 抑制劑 Y-27632 * 在干細(xì)胞培養(yǎng)基中制備細(xì)胞懸液。

4、以 2:1 （v/v） 的比例輕輕混合VitroGel STEM 與細(xì)胞懸液。（查看表1或表2不同培養(yǎng)周期不同培養(yǎng)容器的推薦體積）

5、將含有 10 μM/mL Y-27632 的干細(xì)胞培養(yǎng)基以 5:1 （v/v） 的比例加入細(xì)胞-水凝膠混合物中。該比率對于確保hPSC球狀體的良好形成至關(guān)重要。小心地吹打，使培養(yǎng)基和混合物均勻混合**。

6、將所需體積的混合物添加到培養(yǎng)容器中，并在37°C，5% CO2的條件下孵育（見表1和表2）。

7、為7天培養(yǎng)周期添加培養(yǎng)基：在第3天或第4天，將所需體積的干細(xì)胞培養(yǎng)基（不含Y-27632）直接添加到培養(yǎng)容器中（參見表1中的“Additional medium”體積）。

* 推薦的細(xì)胞密度為 0.2-5 X 106 個細(xì)胞/mL，水凝膠懸浮培養(yǎng)物中的最終細(xì)胞接種密度約為 0.1-5 X 105 個細(xì)胞/mL。細(xì)胞接種密度應(yīng)針對單個細(xì)胞類型進(jìn)行優(yōu)化，并且還取決于所需的干細(xì)胞球狀體的最終大小。
**干細(xì)胞培養(yǎng)基和細(xì)胞-水凝膠混合物的混合比例可以在1:1至20:1 v/v比例之間調(diào)節(jié)，具體取決于最終混合物的所需粘度和培養(yǎng)條件。如果混合比高于5:1 v/v，則可能需要軌道振蕩器或離心瓶，并將其設(shè)置為10-40 rpm的速度以維持細(xì)胞懸液的狀態(tài)。

注意：3D hPSC 球狀體也可以由在常規(guī) 2D 單層中培養(yǎng)的 hPSC 制成。如果使用單層hPSC培養(yǎng)物，請使用合適的解離試劑（根據(jù)制造商的建議）解離細(xì)胞，然后從步驟3開始繼續(xù)。

表 1 推薦7天培養(yǎng)周期的體積 表 2 推薦3-4天培養(yǎng)周期的體積
二、3D 內(nèi)胚層和中/后腸分化與VitroGel STEM

收集hPSC球狀體并通過以下方式分化為內(nèi)胚層：

1、用移液管將 hPSC 球狀體轉(zhuǎn)移到離心管中。

2、100 x g 離心3分鐘。

3、小心地除去上清液和水凝膠層，收集細(xì)胞沉淀（圖4）。
注意：或者，可以使用VitroGel細(xì)胞回收溶液的改良無酶細(xì)胞回收方法*（查看下面的使用VitroGel®細(xì)胞回收溶液進(jìn)行細(xì)胞收獲的方案）。

4、用內(nèi)胚層分化培養(yǎng)基重懸hPSC球狀體。

5、將VitroGel STEM與hPSC球狀體懸浮液以 2:1 （v/v） 的比例混合。

6、將額外的內(nèi)胚層培養(yǎng)基與步驟5中的細(xì)胞 - 水凝膠混合物以5:1（v/v）的比例混合以進(jìn)行懸浮培養(yǎng)3天。（不同培養(yǎng)容器的推薦體積見表2）

7、3天后，通過重復(fù)步驟1-3收獲內(nèi)胚層球狀體。

8、在中/后腸分化培養(yǎng)基中制備內(nèi)胚層球狀體懸浮液。

9、將VitroGel STEM與hPSC球狀體懸浮液以 2:1 （v/v） 的比例混合。

10、將額外的中/后腸培養(yǎng)基與步驟9中的細(xì)胞 - 水凝膠混合物以5:1（v/v）的比例混合用于懸浮培養(yǎng)2-4天。（不同培養(yǎng)容器的推薦體積見表2）

三、VitroGel細(xì)胞回收溶液進(jìn)行細(xì)胞收獲

1、將VitroGel細(xì)胞回收溶液（2-5X體積）直接添加到培養(yǎng)板或培養(yǎng)管中（圖5）。

2、搖晃或吹打 3-5 次混勻。

3、37°C 下孵育 3-5 分鐘。

4、轉(zhuǎn)移到離心管中， 100 x g 離心3-5分鐘。

5、小心地除去上清液和水凝膠層，收集細(xì)胞沉淀（圖4）。
四、類器官的形成和成熟

收集中/后腸球狀體，并通過以下方式形成類器官：

1、使用移液管將中腸/后腸球體從培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到離心管中。
2、100 x g 離心3分鐘。
3、小心地去除上清液和水凝膠層，收集細(xì)胞沉淀（圖4）。
4、將VitroGel ORGANOID置于室溫或加熱至37°C。
5、將 1 mL VitroGel ORGANOID加入 500 μL 細(xì)胞懸液中，小心吹打 5-10 次以徹底混合（保持VitroGel和細(xì)胞懸液的混合比例為 2:1 v/v）。
注意：如果水凝膠中需要關(guān)鍵的生長因子，如R-spondin，Noggin或EGF來支持類器官培養(yǎng)，請用3倍關(guān)鍵生長因子制備細(xì)胞懸液（有關(guān)詳細(xì)信息，請查看VitroGel®ORGANOID操作指南 ）。
6、將水凝膠混合物轉(zhuǎn)移到孔板中。輕輕傾斜/旋轉(zhuǎn)孔板，以確保均勻覆蓋每個孔的底部。

下面列出不同培養(yǎng)板的水凝膠推薦體積。 7、混合物置于在室溫下穩(wěn)定10-15分鐘。
8、添加培養(yǎng)基小心地覆蓋水凝膠。
9、下面列出不同培養(yǎng)板的推薦體積： 10、將培養(yǎng)板放入培養(yǎng)箱中，并根據(jù)實驗方案更換覆蓋培養(yǎng)基。

注意：更換50-80%的覆蓋培養(yǎng)基。如果在類器官培養(yǎng)過程中切換到其他培養(yǎng)基，請 100% 更換覆蓋培養(yǎng)基。避免在更換培養(yǎng)基期間干擾水凝膠。

#  結(jié)果和討論  #

一、VitroGel STEM維持hPSC的多能性

培養(yǎng)hPSC的關(guān)鍵問題之一是不必要的自發(fā)分化，導(dǎo)致多能性喪失。由于分化細(xì)胞群的純度降低，這將對基因編輯、組織類器官開發(fā)、細(xì)胞重編程、生化測定和 DNA/RNA 測序等下游應(yīng)用產(chǎn)生影響。這在基于干細(xì)胞的療法中具有重要的意義， 分化細(xì)胞的純度對于恢復(fù)組織功能至關(guān)重要。在VitroGel STEM 中培養(yǎng) 3 天的 3D hPSC 球體上免疫熒光染色顯示，3D hPSC 球狀體保留了多能性標(biāo)志物 SSEA、OCT4、SOX2 和 TRA-1-60 的高表達(dá)水平（圖7）。 圖7 3D hPSC 球狀體中關(guān)鍵多能標(biāo)記物的表達(dá)。（上）3天后，形成約100 μM的hPSC球狀體。（下）高質(zhì)量的hPSC球狀體在3 d內(nèi)形成，并表達(dá)關(guān)鍵的多能性標(biāo)志物SSEA4、OCT4、SOX2和TRA-1-60。

二、hPSC 球狀體分化為中/后腸類器官

 hPSC球狀體很容易分化為內(nèi)胚層。在第3天，收獲hPSC球狀體并在VitroGel STEM中用內(nèi)胚層分化培養(yǎng)基傳代培養(yǎng)。到第6天，產(chǎn)生約200 μM的內(nèi)胚層球狀體（圖8）。內(nèi)胚層球狀體呈致密球形。然后收獲內(nèi)胚層球狀體，并在VitroGel ORGANOID中用中/后腸分化培養(yǎng)基傳代培養(yǎng)。中腸/后腸分化一天后，類器官的總體形態(tài)發(fā)生劇烈變化（圖8，第7天），類器官的表面似乎更“不規(guī)則”，表明細(xì)胞“出芽”，這是上皮組織的共同特征。到第8天，形成更多的上皮“芽”。免疫熒光成像證實，這些類器官表達(dá)關(guān)鍵的上皮標(biāo)志物E-Cadherin和中/后腸標(biāo)志物CDX2（圖8）。

VitroGel水凝膠的創(chuàng)新方法產(chǎn)生了高質(zhì)量的hPSC球狀體以及類器官。球狀體和類器官的大小是均勻一致的。此外，VitroGel水凝膠支持中/后腸類器官的進(jìn)一步分化和成熟。 圖8  分化過程中內(nèi)胚層球狀體（第 6 天）和中/后腸（第 7 天和第 8 天）類器官的形態(tài)。（上）分化過程中內(nèi)胚層球狀體（第6天）和中/后腸（第7天和第8天）類器官的形態(tài)。（下）中/后腸類器官表達(dá)關(guān)鍵標(biāo)志物CDX2和上皮標(biāo)志物E-Cadherin。

三、VitroGel ORGANOID 支持中/后腸類器官的長期培養(yǎng)和成熟

在第9天確認(rèn)中腸/后腸的形成后，收獲細(xì)胞并將中腸/后腸與VitroGel ORGANOID混合以進(jìn)行類器官的形成和成熟（圖9）。VitroGel ORGANOID能夠促進(jìn)類器官長期培養(yǎng)。到第16天，類器官的尺寸增加，上皮芽明顯增多，這表明類器官進(jìn)一步生長和成熟。
總之，這項研究表明VitroGel STEM可用于培養(yǎng)和維持hPSCs 3D球狀體。甚至可以在從凍存中立即復(fù)蘇并形成球狀體后促進(jìn)hPSC細(xì)胞的恢復(fù)。使用VitroGel STEM形成的3D hPSC球狀體表達(dá)高水平的關(guān)鍵多能性標(biāo)志物， 保持了hPSC的高質(zhì)量。形成的hPSC球狀體可以很容易地分化成類器官。VitroGel ORGANOID能夠有效地促進(jìn)類器官的進(jìn)一步生長和發(fā)育，從而實現(xiàn)這些類器官的長期高質(zhì)量培養(yǎng)。研究表明，VitroGel STEM和VitroGel ORGANOID有效地簡化類器官分化過程，培養(yǎng)的類器官均一性高， 可重復(fù)性高，提高了下游檢測的成功率。