嵌合抗原受體（CAR）T細胞治療是適應性免疫治療的前沿。CAR-T細胞是由T細胞設計而來的，通過促進癌細胞表面的相互作用來特異性地靶向腫瘤細胞。CAR-T細胞的激活導致了由CAR-T細胞產(chǎn)生的細胞因子和趨化因子產(chǎn)生的細胞信號通路的增加，以破壞靶向腫瘤細胞。這篇綜述旨在展示使用不同類型的檢測方法來檢測CAR-T或T細胞活化和殺傷靶腫瘤細胞的效果。

 

CD19特異性CAR-T治療，Kymriah®和Yescarta®分別治療急性淋巴細胞白血�。ˋLL）和非霍奇金淋巴瘤，為臨床中具有更多CAR-T靶點的其他CAR-T治療打開了大門。到目前為止，主要成功的藥物是靶向血液惡性腫瘤。它比實體腫瘤更容易靶向，而實體腫瘤由于免疫抑制微環(huán)境而具有更高的屏障（Wang et al.）。

 

CAR-T設計包括一個抗原結(jié)合位點、鉸鏈和間隔區(qū)，以及細胞內(nèi)激活域。第一代表達一個T細胞內(nèi)激活信號域（CD3ζ），而第三代現(xiàn)在通常表達共刺激域（CD28，或4-1BB）（Androulla和Lefkothea）。

 

一、CAR-T細胞活化

當CAR-T細胞識別腫瘤抗原并與腫瘤細胞結(jié)合時，細胞因子、穿孔素和顆粒酶的釋放，會導致腫瘤細胞和周圍間質(zhì)中的細胞死亡（Benmebrarek et al.）。這些細胞因子可包括IFNγ、TNFα、IL-2和IL-8。在模擬CAR-T治療的共培養(yǎng)體外模型系統(tǒng)中，可以在細胞上清液檢測到。

 

 

Von Scheidt等使用AlphaLISA檢測了在存在雙特異性cMyc/CD40抗體的共培養(yǎng)環(huán)境下，CAR-T細胞產(chǎn)生的IFNγ。cMyc標簽僅存在于CAR-T細胞中，CD40在抗原提呈細胞（APCs）上表達，包括樹突狀細胞、單核細胞、巨噬細胞和B細胞的亞群。在CD40+APCs通過流式細胞術(shù)和IFNγ釋放來檢測CAR-T細胞增殖，其對照組為未轉(zhuǎn)導CAR分子的僅包含c-myc tagged anti-HER2。

 

Copyright: von Scheidt, B. et al. Enterotoxins can support CAR T cells against solid tumors. PNAS 116:50 (2019). Figure reproduced with permissions granted by PNAS.

 

二、CAR-T殺傷功能檢測

除了使用細胞因子的釋放來測量CAR-T細胞的活性外，對靶向腫瘤細胞群中特異性細胞裂解的檢測也顯示了CAR-T細胞的殺傷活性。DELFIA EuTDA細胞毒性試劑安全、快速的用BATDA試劑標記靶細胞，一旦進入細胞，內(nèi)酯酶裂解BATDA底物形成TDA，不能再穿過細胞膜屏障。標記靶細胞的裂解釋放上清液中的TDA，然后將其轉(zhuǎn)移到檢測板上，并與銪溶液結(jié)合生成熒光分子EuTDA。信號與靶細胞的死亡呈現(xiàn)正相關(guān)。

 

Du S-H等使用DELFIA EuTDA細胞毒性試劑、Raji和Daudi細胞，比較了多種抗CD19 CAR分子的CAR-T細胞的殺傷功能。如下圖，相對于對照組Mock和GFP CAR-Ts，幾乎所有CAR分子均使得殺傷率顯著增加。證明了將CAR-T添加到T細胞亞群和提高細胞殺傷能力是有效的。

 

Copyright: Du S-H, Li Z, Chen C, Tan W-K, Chi Z, Kwang TW, et al. (2016) Co-Expansion of Cytokine-Induced Killer Cells and Vγ9Vδ2 T Cells for CAR T Cell Therapy. PLoS ONE 11(9): e0161820.

 

三、聯(lián)合免疫療法

免疫療法的另一種策略是尋找能增強T細胞活性的小分子或生物制劑。靶向CTLA4或PD1途徑的檢查點抑制劑分子。檢查點抑制劑靶向T細胞上的抑制性受體，重新激活抗腫瘤免疫反應（Havel et al.）。

Dextaras等依據(jù)上述思路篩選小分子，通過檢測T細胞活化的標志物-IFNγ，使用HTRF技術(shù)來篩選可以促使IFNγ分泌增加的小分子。

 

Dexesas等人篩選了大約500種小分子。研究發(fā)現(xiàn)36個活性分子增加了IFNγ的分泌。這些結(jié)果通過正交分析，如細胞增殖，并通過qRT-PCR，最終得到4種化合物，認為可針對BRAF突變黑色素瘤患者進行下一步研究。

 

Copyright: Dextras, C. et al. (2020). Identification of small molecule enhancers of immunotherapy for melanoma. Scientific Reports. 10:5688

體外CAR-T或T細胞的活化可以使用AlphaLISA和HTRF等均相檢測技術(shù)檢測IFNγ來評估。方法簡單，靈敏，穩(wěn)定，以最少的樣本消耗最快的獲得結(jié)果。此外，共培養(yǎng)實驗中的靶細胞死亡可以使用DELFIA EuTDA細胞毒性試劑來檢測。穩(wěn)定的熒光替代更傳統(tǒng)的Cr51釋放檢測。

 

參考文獻

1.Wang, Z. et al. (2017). Current status and perspectives of chimeric antigen receptor modified T cells for cancer treatment. Protein Cell, 8:896-925

2.Androulla and Lefkothea (2018). CAR T-cell Therapy: A New Era in Cancer Immunotherapy. Current Pharmaceutical Biotechnology, 19 p5-18

3.Benmebarek, M. et al. (2019). Killing Mechanisms of Chimeric Antigen Receptor (CAR) T Cells. International Journal of Molecular Sciences, 20:1283

4.Von Scheidt, B. et al. (2019) Enterotoxins can support CAR T cells against solid tumors. PNAS 116:50.

5.Du S-H, Li Z, Chen C, Tan W-K, Chi Z, Kwang TW, et al. (2016) Co-Expansion of Cytokine-Induced Killer Cells and Vγ9Vδ2 T Cells for CAR T Cell Therapy. PLoS ONE 11(9):

e0161820.

6.Havel, J. et al. (2019) The evolving landscape of biomarkers for checkpoint inhibitor immunotherapy. Nat Rev Cancer 19(3): 133–150

7.Dextras, C. et al. (2020). Identification of small molecule enhancers of immunotherapy for melanoma. Scientific Reports. 10:5688