一、實驗目的
通過本實驗學習和掌握堿裂解法提取質(zhì)粒的原理和步驟。
二、實驗原理
從細菌中分離質(zhì)粒DNA 的方法都包括3個基本步驟：培養(yǎng)細菌使質(zhì)粒擴增；收集和裂解細胞：分離和純化質(zhì)粒DNA。采用溶菌酶可以破壞菌體細胞壁，十二烷基磺酸鈉(SDS)和Triton X-100 可使細胞膜裂解。經(jīng)溶菌酶和SDS 或Triton X-100 處理后，細菌染色體DNA 會纏繞附著在細胞碎片上，同時由于細菌染色體DNA 比質(zhì)粒大得多，易受機械力和核酸酶等的作用而被切斷成不同大小的線性片段。
堿裂解法提取質(zhì)粒是根據(jù)共價閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA與線性染色體DNA在拓撲學上的差異來分離它們。在pH值介于12.0～12.5這個狹窄的范圍內(nèi)，線性的DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)解開而被變性，盡管在這樣的條件下，共價閉環(huán)質(zhì)粒DNA的氫鍵會被斷裂，但兩條互補鏈彼此相互纏繞，仍會緊密地結(jié)合在一起。當加入pH4.8的乙酸鉀高鹽緩沖液恢復pH至中性時，共價閉合環(huán)狀的質(zhì)粒DNA的兩條互補鏈仍保持在一起，因此復性迅速而準確，而線性的染色體DNA的兩條互補鏈彼此已完全分開，復性就不會那木迅速而準確，它們纏繞形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，通過離心，染色體DNA與不穩(wěn)定的大分子RNA，蛋白質(zhì)-SDS復合物等一起沉淀下來而被除去。
質(zhì)粒DNA小量提取法對于從大量轉(zhuǎn)化子中制備少量部分純化的質(zhì)粒DNA十分有用。這些方法共同特點是簡便、快速，能同時處理大量試樣，所得DNA有一定純度，可滿足限制酶切割、電泳分析的需要。
三、主要試劑
1． 溶液Ⅰ：50 mmol/L葡萄糖，25mmol/LTris (pH 8.0) ，10 mmol/L EDTA（pH 8.0）
2． 溶液Ⅱ：0.2 mol/L NaOH，1% SDS（新鮮配制）
3． 溶液Ⅲ：5 mol/L乙酸鉀 60 mL，冰乙酸11.5 mL，水28.5 mL
4. 70%乙醇
5. 氯仿: 按氯仿:異戊醇＝24:1 體積比加入異戊醇。氯仿可使蛋白變性并有助于液相與有機相的分開,異戊醇則可起消除抽提過程中出現(xiàn)的泡沫。氯仿均有很強的腐蝕性。
6. RNaseA：將RNA酶溶于10 mmol/L Tris. (pH7.5)、15 mmol/L NaCl中，配成10 mg／mL的濃度，于100℃加熱15min，緩慢冷卻至室溫，保存于-20℃。
7. LB+Amp100培養(yǎng)基：LB液體培養(yǎng)基內(nèi)加入100ug/mL的氨芐青霉素。注意Amp遇高溫分解，待培養(yǎng)基溫度低于60℃時加入。
四、儀器耗材
恒溫搖床、冷凍離心機、移液槍一套、制冰機、三角瓶、Eppendorf管、試管、培養(yǎng)皿、試劑瓶、超凈工作臺。
五、實驗步驟
1. 從平板上挑取單克隆，加入含有3mL LB+Amp100的試管中，37℃振蕩培養(yǎng)過夜。
2. 取培養(yǎng)物倒入1.5 mL微量離心管中，4000 r/min 離心2 min。
注：剩余培養(yǎng)物放置4℃，用于保菌。
3. 倒出培養(yǎng)液，使細胞沉淀盡可能干燥。
4. 將細菌沉淀懸浮于100 μL溶液Ⅰ中，充分振蕩混勻，室溫放置5 min。
5. 加200 μL溶液 Ⅱ（新鮮配制），蓋緊管口，顛倒混勻內(nèi)容物，將離心管放冰上5 min 。
6. 加入150 μL溶液 Ⅲ（冰上預冷），蓋緊管口，顛倒數(shù)次使混勻。冰上放置5 min。
7. 12000 r/min ，離心15 min ，將上清轉(zhuǎn)至另一離心管中。350μL
8. 向上清中加入等體積氯仿/異戊醇（24:1）（去蛋白），反復混勻，10000 r/min，離心10 min，將上清轉(zhuǎn)移到另一離心管中。該步驟可以不做。
9. 向上清加入2倍體積乙醇700μL，混勻后，室溫放置15-30min。10000r/min離心10 min。倒去上清液，把離心管倒扣在吸水紙上，吸干液體。
10. 用500 μL 70% 乙醇輕輕洗滌質(zhì)粒DNA沉淀，離心10000r/min離心5min棄上清，干燥。
11. 加入適量（20-50 μL）的無菌水，室溫使DNA完全溶解，-20℃保存。
六、注意事項
1. 溶液II需要新鮮配制。
2. 加入溶液II后不能劇烈震蕩。
3. 沉淀DNA 通常使用冰乙醇，在低溫條件下放置時間稍長可使DNA 沉淀完全。沉淀DNA 也可用異丙醇(一般使用等體積)，且沉淀完全，速度快，但常把鹽沉淀下來，所以多數(shù)還是用乙醇。