細胞因子功能及使用常見問題解答
常見問題
問：常見細胞因子有哪些？有什么功能？
答：(1) 白細胞介素（interleukin, IL)：由淋巴細胞、單核細胞或其它非單個核細胞產生的細胞因子，在細胞間相互作用、免疫調節(jié)、造血以及炎癥過程中起重要調節(jié)作用，凡命名的白細胞介素的cDNA基因克隆和表達均已成功，已報道有三十余種（IL-1―IL-38）。
(2) 集落刺激因子（colony stimulating factor, CSF)：根據不同細胞因子刺激造血干細胞或分化不同階段的造血細胞在半固體培養(yǎng)基中形成不同的細胞集落，不同CSF不僅可刺激不同發(fā)育階段的造血干細胞和祖細胞增殖的分化，還可促進成熟細胞的功能。
(3) 干擾素（interferon, IFN)各種不同的IFN生物學活性基本相同，具有抗病毒、抗腫瘤和免疫調節(jié)等作用。
(4) 腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor, TNF)：兩類TNF基本的生物學活性相似，除具有殺傷腫瘤細胞外，還有免疫調節(jié)、參與發(fā)熱和炎癥的發(fā)生。大劑量TNF-α可引起惡液質，因而TNF-α又稱惡液質素（cachectin)。
問：細胞因子凍干產品的使用要注意什么？
答：凍干粉產品在運輸過程中會有粉末黏在管壁或蓋上，使用前請勿開蓋并離心處理 20-30 秒（高速離心機，約13000 rpm），使附于管蓋或管壁的蛋白收集于管底。亦可使用最高轉速為4000-4500rpm的離心機離心5分鐘（3000-3500rpm），也能達到類似的效果。雖然有時管中蛋白粉末不可見或者可視數(shù)量很少，我們的質控體系保證每管中所含的蛋白量是準確且足量的。
問：細胞因子凍干產品如何溶解？
答：(1) 使用前準備：使用前先離心（見上文），使附于管蓋或管壁的蛋白沉于管底；
(2) 溶解液
① 要求用無菌去離子水溶解的產品，務必不可用鹽溶液，避免過高的鹽濃度造成蛋白不可逆的析出；不可用PBS或培養(yǎng)液（1640或DMEM等）直接溶解，否則蛋白可能無法完全溶解，從而導致蛋白活性不足或失活；
② 要求用鹽溶液溶解的產品，請依照說明書上的濃度，同樣也是為了避免過高的鹽濃度；
③ 亦可聯(lián)系我們的技術支持獲得關于單獨產品的溶解液的選擇。
(3) 溶解到指定的濃度：
① 我們建議最佳濃度一般不低于100 μg/mL，如10μg的凍干粉，則加入10 μL-100μL的溶解液；
② 高于或低于最佳濃度，細胞因子可能會不穩(wěn)定，或者聚集（aggregation），導致部分蛋白沉淀，影響其活性。高于這個濃度范圍，可能會超過該蛋白的最大溶解濃度，即蛋白無法完全溶解；
③ 用移液槍輕吹混勻，或將管蓋蓋好后輕柔顛倒數(shù)次進行混勻，低速離心數(shù)秒；溶解時不可振蕩（vortex，即用渦旋儀進行快速振蕩），避免因化學鍵的斷裂造成蛋白失活；
④ 將溶解后的蛋白在室溫放置數(shù)分鐘，以保證蛋白能夠充分溶解。建議將不易溶解（slow to dissolve）的蛋白用低速搖床促進其溶解。
(4) 溶解后的保存：
不建議用推薦的溶解液做進一步稀釋。溶液中的蛋白很容易黏附在凍存管壁，且很難與管壁分離。使用含有載體蛋白的溶液（該溶液通常是指pH近中性，有一定緩沖能力的緩沖液，如PBS，培養(yǎng)液等）預先封閉塑料管壁上的蛋白結合位點，使細胞因子或重組蛋白不會黏于管壁，方可更好地保存蛋白溶液；
① 短期保存：在一般情況下，上文中建議的濃度是較高的。我們建議將該溶液用含載體蛋白（如0.1% BSA、10% FBS、5% HSA）的溶液進行稀釋，分裝存于4℃并于一周內用完，分裝體積不要小于20μL。否則稀釋后的細胞因子或重組蛋白很容易會粘附在管壁或瓶壁上，使得溶液中的細胞因子或重組蛋白的濃度下降，從而影響其生物活性；
② 長期保存：若配置的溶液無法一次用盡，我們建議用含載體蛋白（如0.1% BSA、10% FBS、5% HSA）的溶液進一步稀釋，分裝凍存于-20℃至-80℃，分裝體積不要小于20μL；
③ 在做無血清培養(yǎng)或動物的體內實驗時，細胞因子中不能含有BSA，F(xiàn)BS或HSA等動物或人的成分，我們建議選用小包裝，每次使用一支，用后即廢棄�；蛘哂煤�5%海藻糖（Trehalose）的溶液來稀釋已溶解的細胞因子或重組蛋白，然后分裝凍存，分裝體積不要小于20μL。
問：重組蛋白的檢測都有哪些？
答：基因序列：經N端序列分析。必要時，使用SDS-PAGE，HPLC和質譜分析等方法與標準品進行比對；
蛋白純度：
(1) 經SDS-PAGE
(2) HPLC分析
生物活性：經相關的體外或體內生物活性檢測，詳見下文；
蛋白含量：
(1) 紫外分光光度
(2) BCA蛋白定量測定
(3) SDS-PAGE分析
(4) HPLC法與標準品比對
內毒素含量：經動態(tài)LAL（西方鱟試劑）法或TAL（東方鱟試劑）法測定；
無菌：所有蛋白溶液在分裝凍干前經0.22um濾膜過濾除菌，在B+A級環(huán)境分裝、凍干及封蓋；
分子量：SDS-PAGE分析；
宿主蛋白殘留：熒光染色；
宿主DNA殘留：ELISA試劑盒；
支原體檢測：支原體試劑盒。
問：重組蛋白的生物活性是什么？
答：蛋白質的生物活性是各種蛋白質功能的體現(xiàn)�；蛘吣梢岳斫庵挥械鞍踪|有活性的概念，它才能執(zhí)行它的功能。具有生物活性的蛋白質稱為活性蛋白質，即具有生物活性的活性蛋白質。從理論上講，天然蛋白都是活性蛋白，而重組蛋白并不總是活性蛋白，因為重組蛋白的產生是一個復雜的過程，其中許多因素對其生物活性至關重要，例如理想的表達系統(tǒng)、合適的表達載體、純化等。
1. ED50的計算：
逐典的蛋白產品ED50（即半數(shù)有效濃度，其定義是對特定細胞引起 50% 最大反應的蛋白濃度，單位為ng/mL）可在蛋白產品COA中獲取，這種活性表示法僅適用于劑量反應曲線呈 S 形的細胞因子。將1 ng/mL ED50 定義為 1 unit，則產品生物學活性 Specific Activity 的換算公式如下：
Specific Activity（units/mg）= 1 × 10 6 ÷ ED50（ng/mL）
以上計算公式并不適用于International Units（IU）和ED50的換算關系，我們建議采用國際標準品對比相同實驗獲得該蛋白的IU值。
2. 影響ED50的因素：
產品說明書中的實驗方案只是確認該產品的ED50，如果客戶的實驗類型與我們相同，則可以按照產品標定的生物活性進行實驗；若實驗采用了不同的細胞種類或方法，我們建議客戶按照梯度濃度通過實驗獲得最佳ED50值，并依據此數(shù)值制定相應的實驗方案以及產品的添加量。
