細(xì)胞培養(yǎng)是指在人工創(chuàng)造的與體內(nèi)生長(zhǎng)環(huán)境相似，如無(wú)菌條件、適宜的溫度、pH、CO2環(huán)境和適宜營(yíng)養(yǎng)條件下，使細(xì)胞生長(zhǎng)、繁殖并維持主要結(jié)構(gòu)和功能的技術(shù)。
 

細(xì)胞培養(yǎng)是細(xì)胞生物學(xué)研究方法中最常用也是最重要的技術(shù)之一，在現(xiàn)代醫(yī)學(xué)、生物科學(xué)、農(nóng)業(yè)科學(xué)等領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用以提供研究模型和實(shí)驗(yàn)材料。在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，完全培養(yǎng)基對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)起到關(guān)鍵作用，決定實(shí)驗(yàn)成功與否。而血清是完全培養(yǎng)基中的關(guān)鍵成分之一，除為細(xì)胞生長(zhǎng)提供基本營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、結(jié)合蛋白、一些參與解毒代謝的微量元素和可起到中和保護(hù)的酶類之外，還可以保護(hù)細(xì)胞免受機(jī)械損傷，因此被業(yè)內(nèi)認(rèn)為是細(xì)胞增殖過(guò)程中最重要的試劑。在生命科學(xué)領(lǐng)域的細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)中，動(dòng)物血清的應(yīng)用十分廣泛，特別是牛來(lái)源血清。而牛源血清又分為胎牛血清、新生牛血清和小牛血清，它們的區(qū)別方式主要由于牛齡和采血方式不同，其中胎牛血清因其抗體水平含量低對(duì)后續(xù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響小、生長(zhǎng)因子含量水平高利于細(xì)胞增殖而應(yīng)用最廣。因此關(guān)注胎牛血清的品級(jí)、質(zhì)量以及使用過(guò)程的一些注意事項(xiàng)，會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果起到直接影響作用，并可以確保科研人員在實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程中的安全性。
 

今天我們就來(lái)看看在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中血清使用方面常見(jiàn)的問(wèn)題，如：血清儲(chǔ)存條件、如何程序解凍、細(xì)胞污染與血清之間的關(guān)系、傳說(shuō)中的“黑膠蟲(chóng)”是什么以及血清熱滅活是否有必要等等，“工欲善其事，必先利其器”，通過(guò)今天的解析與學(xué)習(xí)可以讓我們?cè)谧黾?xì)胞培養(yǎng)相關(guān)實(shí)驗(yàn)時(shí)事半功倍！那我們就開(kāi)始吧~

 

Q1：血清長(zhǎng)期儲(chǔ)存的條件和方法是什么？

A1：血清如需長(zhǎng)期保存，則必須儲(chǔ)存于-10℃或更低溫冰箱中，建議存放于-20℃的冰箱中。研究表明儲(chǔ)存在-80℃條件下的血清在性能方面變化不大，但由于解凍時(shí)溫差過(guò)大，會(huì)導(dǎo)致析出更多沉淀，使得背景雜亂，因此血清長(zhǎng)期保存不建議處于-80℃條件下。如果近期會(huì)頻繁使用血清，我們建議不要在4℃條件下存放超過(guò)1個(gè)月，若一次無(wú)法用完整瓶建議分裝后保存，且要避免反復(fù)凍融。另外，血清冰凍后體積會(huì)增加約10%，因此血清分裝時(shí)請(qǐng)留意預(yù)留一定的體積空間。

 

Q2：如何進(jìn)行血清的程序性解凍？血清才不會(huì)使產(chǎn)品質(zhì)量受損？

A2：程序性解凍血清可以確保血清制品質(zhì)量的穩(wěn)定性，且不會(huì)因?yàn)闇夭钸^(guò)大而析出過(guò)多蛋白等沉淀。程序性解凍方法是于實(shí)驗(yàn)開(kāi)始之前將冷凍的血清置于4℃冰箱中融解，并且在解凍過(guò)程中每隔1小時(shí)搖勻一次，使溫度與成分均一，減少沉淀析出，直至全部解凍，然后再移入室溫條件下使用。

 

Q3：血清解凍后發(fā)現(xiàn)絮狀沉淀該如何處理？

A3：造成血清發(fā)生絮狀沉淀的原因主要是血清解凍過(guò)程中溫差帶來(lái)了脂蛋白變性和纖維蛋白析出，沉淀本身不會(huì)影響血清質(zhì)量，也不會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成影響。但如必須處理沉淀，則可通過(guò)離心方式去除，如500-1000×g離心5-10 min。

 

Q4：血清沉淀是什么？

A4：用于細(xì)胞培養(yǎng)的胎牛血清及其他血類制品中均存在各種類型的沉淀，如纖維蛋白和磷酸鈣等。一些絮狀沉淀主要就是纖維蛋白，通常我們?nèi)庋劭梢?jiàn)，大小在1-2mm之間；而磷酸鈣在顯微鏡下觀察呈現(xiàn)布朗運(yùn)動(dòng)的小黑點(diǎn)，通常被誤認(rèn)為是微生物污染。血清沉淀往往比較難以預(yù)測(cè)和控制，但幸運(yùn)的是這些沉淀不會(huì)影響血清品質(zhì)。

 

Q5：血清中的小黑點(diǎn)是“黑膠蟲(chóng)”么？

A5：血清解凍過(guò)程溫差過(guò)大、經(jīng)反復(fù)凍融或通過(guò)熱滅活處理后更容易產(chǎn)生沉淀，這些沉淀物在鏡下觀察時(shí)有一些會(huì)呈現(xiàn)以布朗運(yùn)動(dòng)的小黑點(diǎn)，業(yè)內(nèi)流行一種“黑膠蟲(chóng)”污染的說(shuō)法，但“黑膠蟲(chóng)”一直以來(lái)都是極為神秘的存在，至今科學(xué)家們也沒(méi)有完整的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以證實(shí)它究竟是一種生物還是非生物，更有人認(rèn)為“黑膠蟲(chóng)”是血清的原蟲(chóng)，或誤以為是細(xì)菌或真菌污染。但科學(xué)家通過(guò)進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)它們更可能是血清中的蛋白結(jié)晶。這種結(jié)晶可能為蛋白析出，如纖維蛋白原凝結(jié)成纖維蛋白；或是鹽析出，如磷酸鈣等；也有一些是膽固醇和脂肪酸。以下圖片就證實(shí)了這一說(shuō)法，如纖維蛋白和磷酸鈣。
 

圖1：上圖分別為纖維蛋白在低倍鏡和高倍鏡下觀察到的圖像，下圖為磷酸鈣在低倍鏡和高倍鏡下觀察到的圖像（箭頭指示的是我們看到的“黑點(diǎn)”）

 

Q6：如何判斷血清污染？

A6：

（1）首先檢查并判斷外包裝是否有破損，一般瓶身破損的血清發(fā)生污染的可能性極大；

（2）將血清接種到血酯板上，培養(yǎng)后看是否有菌落形成；

（3）可通過(guò)質(zhì)量檢測(cè)試劑盒檢測(cè)結(jié)果判定，如支原體檢測(cè)試劑盒等。血清污染主要包括細(xì)菌污染、真菌污染和支原體污染。在細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)想要確定血清存在細(xì)菌污染，可嘗試使用5-10倍濃度青鏈霉素雙抗沖擊培養(yǎng)24-48h；真菌污染的細(xì)胞無(wú)法搶救，應(yīng)立即將細(xì)胞瓶進(jìn)行高壓滅菌處理，并徹底消毒培養(yǎng)箱；支原體污染可考慮更換早期代次細(xì)胞，或使用商品化支原體去除試劑。

 

Q7：細(xì)胞形態(tài)不正常、生長(zhǎng)狀態(tài)異�；蛟鲋乘俾示徛�是否與血清有關(guān)？

A7：細(xì)胞形態(tài)異常需要綜合關(guān)注細(xì)胞代次、傳代操作、培養(yǎng)基和血清等諸多因素。如傳代次數(shù)過(guò)多或傳代時(shí)間過(guò)晚都有可能影響細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)。有些細(xì)胞對(duì)血清具有一定適應(yīng)性，更換新批次血清時(shí)可能出現(xiàn)所含因子水平的差異而導(dǎo)致的細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)受到影響的現(xiàn)象，可以通過(guò)血清梯度替換或者增加細(xì)胞適應(yīng)時(shí)間來(lái)解決此類問(wèn)題。與此同時(shí)也要關(guān)注基礎(chǔ)培養(yǎng)基和傳代操作等方面是否存在一定問(wèn)題。

 

Q8：如何做血清的梯度替換？

A8：當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)需更換血清品牌時(shí)，做程序性梯度替換方案尤為重要，因?yàn)椴煌�品牌的血清所含成分有所差異，血清更換會(huì)使細(xì)胞發(fā)生不適，從而出現(xiàn)細(xì)胞增殖緩慢或細(xì)胞狀態(tài)不佳等情況。建議的梯度替換方法為：完全培養(yǎng)基配置過(guò)程中先用25%新血清與75%原血清進(jìn)行混合，培養(yǎng)傳代1-2次；而后用50%新血清與50%原血清混合培養(yǎng)傳代；再用75%新血清與25%原血清混合培養(yǎng)傳代；最后完全使用新血清培養(yǎng)傳代。

 

Q9：培養(yǎng)基中添加血清和抗生素后可長(zhǎng)期保存嗎?

A9：新鮮培養(yǎng)基中添加血清和抗生素后，建議在2周內(nèi)使用完。

 

Q10：血清的熱滅活是必須的嗎?

A10：實(shí)驗(yàn)表明，經(jīng)熱滅活處理的血清對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)可能僅有微小促進(jìn)或完全沒(méi)有任何作用，甚至通常因高溫處理而損失掉血清中部分營(yíng)養(yǎng)成分從而影響血清質(zhì)量，造成細(xì)胞生長(zhǎng)速率降低。熱滅活過(guò)程中因局部溫度過(guò)高、搖晃不均勻或滅活時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，都會(huì)造成血清品質(zhì)下降，且經(jīng)熱滅活后的血清會(huì)增加發(fā)生蛋白沉淀概率。因此，若非必須血清不需要做熱滅活，而少數(shù)對(duì)補(bǔ)體敏感的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，如某些免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)或腺病毒包裝等，可酌情對(duì)血清進(jìn)行熱滅活操作。

 

Q11：血清熱滅活應(yīng)如何操作？

A11：

1.熱滅活前，必須先將解凍后的血清搖勻，并恢復(fù)至室溫；

2.取部分搖勻血清置于50ml離心管中，并準(zhǔn)備同規(guī)格對(duì)照管一個(gè)；

3.對(duì)照管內(nèi)加入血清等體積水；

4.對(duì)照管內(nèi)插入溫度計(jì)進(jìn)行溫度預(yù)試，當(dāng)溫度達(dá)到 56℃時(shí)將恢復(fù)至室溫的血清放入水浴鍋30min；

5.滅活過(guò)程中需要每隔5min輕輕晃動(dòng)搖勻，以保證溫度均一。

 

Q12：血清為什么存在批間差？

A12：血清批間差是客觀存在的，因?yàn)檠�清制品�?lái)源于天然活體，供體牛只的生理狀況、健康狀況均不同，且受飼養(yǎng)環(huán)境的地形、風(fēng)貌、飲食、水源等影響，體內(nèi)各類蛋白、生長(zhǎng)因子和酶類的含量均有巨大差異，所以血清具有含量復(fù)雜且不固定的特性，批間差異在所難免，因此批間差異小的血清不僅可以保證血清質(zhì)量，確保細(xì)胞培養(yǎng)效果，還能減少由于批間差異帶來(lái)的使用前測(cè)試，且避免實(shí)驗(yàn)結(jié)果的不可重復(fù)性。

 

既然血清在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中如此重要，那么我們又該如何選擇靠譜的血清呢？
 

1.中國(guó)海關(guān)允許進(jìn)口的血源地

世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）對(duì)國(guó)家或地區(qū)動(dòng)物感染性疾病有相關(guān)評(píng)價(jià)指標(biāo)，如瘋牛病風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)指標(biāo)GBR就是根據(jù)瘋牛病風(fēng)險(xiǎn)等級(jí)進(jìn)行地域性風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估及分類。目前世界上僅有一些少數(shù)國(guó)家在OIE對(duì)牛類風(fēng)險(xiǎn)性疾病的評(píng)估中符合中國(guó)海關(guān)要求，因此中國(guó)海關(guān)允許進(jìn)口的血清來(lái)源地有澳大利亞、新西蘭、烏拉圭，這些國(guó)家來(lái)源的牛血類制品的生物安全等級(jí)較高，科研人員在使用相關(guān)來(lái)源的血類制品時(shí)極大降低了感染疾病的風(fēng)險(xiǎn)，市面上其他血源地的血清都是非法走私血清，要選擇在瓶身明確標(biāo)注來(lái)源地的血清產(chǎn)品。

 

2.血源可溯性

由于血清利潤(rùn)價(jià)值高昂、血源緊缺、不同原產(chǎn)國(guó)血清價(jià)格有差異、通過(guò)偽造血清來(lái)源從而進(jìn)行利潤(rùn)賺取使血清用戶深受困擾等原因，使得血源可溯源至關(guān)重要。目前血清行業(yè)中有Oritain指紋識(shí)別技術(shù)，該技術(shù)可為每批血清進(jìn)行來(lái)源溯源認(rèn)證，有效證實(shí)血清產(chǎn)品來(lái)源。

 

3.國(guó)際機(jī)構(gòu)認(rèn)證

國(guó)際血清行業(yè)協(xié)會(huì)（ISIA）成立于2006年6月，旨在建立全球動(dòng)物血清和動(dòng)物源性產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，促進(jìn)和確保血清和動(dòng)物源性產(chǎn)品供應(yīng)符合標(biāo)準(zhǔn)和倫理規(guī)范，現(xiàn)已成為血清行業(yè)規(guī)范及血清供應(yīng)商身份驗(yàn)證標(biāo)準(zhǔn)的制定者。ISIA實(shí)施了供應(yīng)鏈可追溯性的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，這對(duì)確保血清各個(gè)批次的質(zhì)量、安全性和重復(fù)性起了關(guān)鍵作用。該組織在胎牛血清生產(chǎn)過(guò)程中主要對(duì)原料采集、血清加工、產(chǎn)品質(zhì)檢和出國(guó)運(yùn)輸?shù)拳h(huán)節(jié)進(jìn)行監(jiān)控及認(rèn)證。

 

4.進(jìn)口合規(guī)性

合規(guī)的進(jìn)口血清應(yīng)該具備多項(xiàng)資質(zhì)證明文件，包括原產(chǎn)地證明、衛(wèi)生證/健康證/農(nóng)業(yè)部非疫區(qū)證明、進(jìn)口貨物報(bào)關(guān)單以及入境貨物檢驗(yàn)檢疫證明。其中原產(chǎn)地證明（CERTIFICATE OF ORIGIN）可以追溯貨物原產(chǎn)地或制造地，衛(wèi)生證/健康證/農(nóng)業(yè)部非疫區(qū)證明（ HC, HEALTH CERTIFICATE, TES/BSE）可以確保血清供體來(lái)源是健康、非疫區(qū)和無(wú)傳染病的。

 

5.嚴(yán)格質(zhì)控

由于牛血清在人用疫苗和獸用疫苗等生物制藥生產(chǎn)中非常重要，很多國(guó)家都將其納入藥典，在我國(guó)的中華人民共和國(guó)藥典Ch.P、美國(guó)藥典USP和歐洲藥典 EP 中都規(guī)定了牛血清的定義和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，如內(nèi)毒素、總蛋白含量、血紅蛋白、PH、微生物、免疫球蛋白、抗生素等。此外，9種牛類傳染性疾病的檢測(cè)結(jié)果也十分重要，分別是牛呼吸道融合病毒(BRSV)、牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)、 牛細(xì)小病毒(BPV)、藍(lán)舌病毒(BTV)、 牛腺病毒(BAdV)、狂犬病毒(RABV)和呼吸道腸道病毒(REO)等，這些病毒部分是人畜共患病，病毒檢測(cè)不合格的血清甚至?xí)�影響科研人員的健康與安全。因此我們要選擇質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)嚴(yán)格按照各國(guó)藥典要求，并遵循FDA頒布執(zhí)行的cGMP規(guī)范生產(chǎn)流程的血清供應(yīng)商，可在血清生產(chǎn)等各個(gè)環(huán)節(jié)保證產(chǎn)品質(zhì)量。

 

6.批間差異小

批間差異小的血清不僅可以保證血清質(zhì)量，確保細(xì)胞培養(yǎng)效果，還能減少由于批間差異帶來(lái)的使用前測(cè)試，且避免實(shí)驗(yàn)結(jié)果的不可重復(fù)性。