動(dòng)物細(xì)胞/組織總蛋白提取試劑盒使用操作方法
動(dòng)物細(xì)胞/組織總蛋白提取試劑盒，是新一代超快速蛋白質(zhì)提取工具，與傳統(tǒng)的溶液提取法相比，提取的總蛋白無(wú)丟失，不改變蛋白圖譜。越來(lái)越多的證據(jù)表明最常用的 RIPA 緩沖液可能引起不可預(yù)測(cè)的蛋白質(zhì)丟失，產(chǎn)生很多難以解釋的疑難數(shù)據(jù)。離心管柱提取技術(shù)可有效解決蛋白丟失這一問(wèn)題。離心管柱技術(shù)結(jié)合優(yōu)化高效的裂解緩沖液可以更簡(jiǎn)單有效地提取總蛋白。使用離心管柱技術(shù)提取蛋白，提取體系最低可以低至 20μl——有效解決樣品量受限的樣本。試劑盒同時(shí)提供天然和變性?xún)煞N不同的裂解液，可滿足不同下游應(yīng)用的需求。離心管柱技術(shù)從細(xì)胞/組織中提取總蛋白僅需 1-8 分鐘，平均得率可達(dá) 2-8mg/ml。
關(guān)于使用 RIPA buffer 導(dǎo)致蛋白質(zhì)丟失的參考文獻(xiàn)：
1. Bai,B., and Laiho, M. (2012) Proteomics. 12:3044-3048
2. Mukhopadhyay, C. et al. (2016) PNAS 5:8228-8237
3. Li, Q. (2016) Biotechniques. 61:327
4. Ngoka, L. CM. (2008) Proteome Science. 6:30
應(yīng)用
可應(yīng)用于 SDS-PAGE, 免疫印跡, IP, ELISA，酶檢測(cè)及其他應(yīng)用。這個(gè)試劑盒提供了更快的總蛋白提取方法。
提取的的蛋白可以用于小型色譜純化柱純化蛋白的原料使用。
試劑盒組分
50 Preps: 4 Preps：
1. 25ml 變性細(xì)胞裂解液（SD-001） 1. 2.0ml 變性細(xì)胞裂解液（SD-001）
2. 25ml 天然細(xì)胞裂解液（SN-002） 2. 2.0ml 天然細(xì)胞裂解液（SN-002）
3. 50 個(gè)離心管柱 3. 4 個(gè)離心管柱
4. 50 個(gè)收集管 4. 4 個(gè)收集管
5. 2 根塑料研磨棒 5. 1 根塑料研磨棒
**注:試劑盒中的細(xì)胞裂解液不含任何還原劑和伯胺。
運(yùn)輸儲(chǔ)存：常溫運(yùn)輸，室溫保存
重要產(chǎn)品信息
1. Minute TM總蛋白提取試劑盒是一款快速總蛋白提取試劑盒。蛋白酶抑制劑不是必須加入，但是如果下游實(shí)驗(yàn)需要較長(zhǎng)時(shí)間或者蛋白提取后需要保存較長(zhǎng)時(shí)間，建議添加蛋白酶抑制劑。研究蛋白磷酸化，磷酸酶抑制劑應(yīng)在使用前加入裂解液中。（各類(lèi)抑制劑的添加方法請(qǐng)按照抑制劑母液比例，例如母液是
100X，添加時(shí)按照 1：100 添加，即 1ml 裂解液中添加 10ul 抑制劑）。推薦使用 BCA 試劑盒用于
蛋白濃度測(cè)定。
2. 裂解液的使用要根據(jù)下游實(shí)驗(yàn)來(lái)選擇，變性裂解液（SD-001）適合用于 SDS-PAGE，WB 實(shí)驗(yàn)，天然裂解液（SN-002）適合用于 ELISA，IP，CO-IP 等實(shí)驗(yàn)。
3. 使用SD-001變性裂解液提取的蛋白和使用SN-002天然裂解液提取的蛋白，做WB上樣前，仍需加Loadingbuffer 混勻煮沸樣品后上樣。
4. 如果變性裂解液在低溫情況下出現(xiàn)沉淀，在 37 度以上孵育至沉淀復(fù)溶可正常使用。
所需附加材料
1 X PBS
渦旋震蕩儀
臺(tái)式離心機(jī)
BCA 蛋白定量試劑盒
操作方法：
細(xì)胞樣品總蛋白提取
變性總蛋白提�。⊿D-001）SDS-PAGE，WB 實(shí)驗(yàn)適用
A．非貼壁細(xì)胞
1.將離心管柱（filter cartridges）套入接收管中，成為套管放置于冰上預(yù)冷。
2.低速離心收集細(xì)胞，在離心管中加入預(yù)冷的 PBS，500Xg 離心 2-3 分鐘清洗細(xì)胞。棄去上清，剩余與細(xì)胞體積相同體積的 PBS。渦旋震蕩重懸細(xì)胞。
3.加入表格 1 中相應(yīng)體積的細(xì)胞裂解液（SD-001），渦旋震蕩裂解細(xì)胞。（細(xì)胞數(shù)量和裂解液須保證對(duì)應(yīng)關(guān)系，以達(dá)到最佳提取效率）
請(qǐng)注意：部分未完全裂解的細(xì)胞不會(huì)影響樣品質(zhì)量。
4.將細(xì)胞裂解物轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的離心管柱套管中，蓋上蓋子，14,000-16,000Xg 離心 30 秒取出
表格 1，不同細(xì)胞體積應(yīng)加入相應(yīng)體積裂解液（裂解液用量?jī)H供參考，可根據(jù)細(xì)胞數(shù)量增加或減少）
B．貼壁細(xì)胞
天然總蛋白提�。⊿N-002）ELISA，IP，CO-IP，酶活性檢測(cè)等實(shí)驗(yàn)適用
表格 3，不同細(xì)胞體積應(yīng)加入相應(yīng)體積裂解液（裂解液用量?jī)H供參考，可根據(jù)細(xì)胞數(shù)量增加或減少）
表格 4，不同貼壁細(xì)胞量應(yīng)加入相應(yīng)體積裂解液（裂解液用量?jī)H供參考，可根據(jù)細(xì)胞數(shù)量增加或減少）
動(dòng)物組織總蛋白提取
5. 棄去離心管柱，收集管中即是蛋白樣品，可應(yīng)用于下游實(shí)驗(yàn)。
表格 1，不同細(xì)胞體積應(yīng)加入相應(yīng)體積裂解液（裂解液用量?jī)H供參考，可根據(jù)細(xì)胞數(shù)量增加或減少）
細(xì)胞體積（ul）裂解液（ul）相當(dāng)細(xì)胞量# X 107
3 20 0.3
5 50 0.5
10 100 1
20 200 2
40 500 3
﹡NIH3T3 和 293T 細(xì)胞 10ul 體積相當(dāng)于 1X107 個(gè)細(xì)胞
B．貼壁細(xì)胞
1. 將離心管柱（filter cartridges）套入接收管中，成為套管放置于冰上預(yù)冷。
2. 貼壁細(xì)胞生長(zhǎng)至 90-100%融合時(shí)，將預(yù)冷的 PBS 直接加入培養(yǎng)板，培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶中清洗一次，完全吸出上清。
3.按照表 2 中將相應(yīng)體積的細(xì)胞裂解液（SD-001）均勻的加入整個(gè)器皿表面，用移液器反復(fù)吹打幾次以裂解細(xì)胞，將細(xì)胞裂解物迅速轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的離心管柱套管中，蓋上蓋子，14,000-16,000Xg 離心 30 秒取出。（如提取濃度不佳，可減少裂解液使用量）
4. 棄去離心管柱，收集管中即是蛋白樣品，可應(yīng)用于下游實(shí)驗(yàn)。
表格 2，不同貼壁細(xì)胞量應(yīng)加入相應(yīng)體積裂解液（裂解液用量?jī)H供參考，可根據(jù)細(xì)胞數(shù)量增加或減少）
器皿 細(xì)胞數(shù)量 裂解液（ul）
24 孔板 0.1-0.2 Million 50
6 孔板 0.6-0.8 Million 200
25 cm2 培養(yǎng)瓶 1.5-2 Million 500
天然總蛋白提�。⊿N-002）ELISA，IP，CO-IP，酶活性檢測(cè)等實(shí)驗(yàn)適用
A．非貼壁細(xì)胞
1. 將離心管柱（filter cartridges）套入接收管中成為套管，與天然細(xì)胞裂解液（SN-002）共同放置于冰上預(yù)冷。
2. 低速離心收集細(xì)胞，在離心管中加入預(yù)冷的 PBS 清洗細(xì)胞一次，500Xg 離心 2-3 分鐘沉淀細(xì)胞。棄去上清，在管中保留與細(xì)胞體積相同體積的 PBS。旋窩震蕩重懸細(xì)胞。
3. 加入表格 3 中相應(yīng)體積的細(xì)胞裂解液，渦旋震蕩裂解細(xì)胞 15 秒。將離心管放置于冰上 3-5 分鐘然后渦旋震蕩 10 秒。（細(xì)胞數(shù)量和裂解液須保證對(duì)應(yīng)關(guān)系，以達(dá)到最佳提取效率）
4. 將細(xì)胞裂解物轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的離心管柱套管中，蓋上蓋子，14,000-16,000Xg 離心 30 秒取出。
5. 棄去離心管柱，收集管中即是蛋白樣品，可應(yīng)用于下游實(shí)驗(yàn)。
表格 3，不同細(xì)胞體積應(yīng)加入相應(yīng)體積裂解液（裂解液用量?jī)H供參考，可根據(jù)細(xì)胞數(shù)量增加或減少）
細(xì)胞體積（ul） 裂解液（ul） 相當(dāng)細(xì)胞量# X 107
3 25 0.3
5 50 0.5
10 100 1
20 200 2
40 500 3
﹡NIH3T3 和 293T 細(xì)胞 10ul 體積相當(dāng)于 1X107 個(gè)細(xì)胞
B．貼壁細(xì)胞
1. 將離心管柱（filter cartridges）套入接收管中成為套管，與天然細(xì)胞裂解液（SN-002）共同放置于冰上預(yù)冷。
2. 貼壁細(xì)胞生長(zhǎng)至 90-100%融合時(shí)，用預(yù)冷的 PBS 清洗細(xì)胞兩次，完全吸出上清。
3. 按照表 4 中將相應(yīng)體積的細(xì)胞裂解液均勻的加入整個(gè)器皿表面，放置于冰上孵育 5 分鐘，用移液器反復(fù)吹打以裂解細(xì)胞，將細(xì)胞裂解物轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的離心管柱套管中，蓋上蓋子，14,000-16,000Xg 離心 30 秒取出。（如提取濃度不佳，可減少裂解液使用量）
4. 棄去離心管柱，收集管中即是蛋白樣品，可應(yīng)用于下游實(shí)驗(yàn)。
表格 4，不同貼壁細(xì)胞量應(yīng)加入相應(yīng)體積裂解液（裂解液用量?jī)H供參考，可根據(jù)細(xì)胞數(shù)量增加或減少）
器皿 細(xì)胞數(shù)量 裂解液（ul）
24 孔板 0.1-0.2 Million 50
6 孔板 0.6-0.8 Million 250
25 cm2 培養(yǎng)瓶 1.5-2 Million 500
動(dòng)物組織總蛋白提取
變性總蛋白提�。⊿D-001）SDS-PAGE，WB 實(shí)驗(yàn)適用
以下步驟是從 15-20mg 動(dòng)物組織中提取，對(duì)于不同的樣品起始量，需按比例調(diào)整裂解液的用量。
1. 將離心管柱（filter cartridges）套入接收管中，成為套管放置于冰上預(yù)冷。
2. 將 15-20mg 新鮮/冷凍組織放置于離心管柱套管上，用塑料研磨棒向下按壓反復(fù)扭轉(zhuǎn)研磨 50-60 次，加入200ul 變性細(xì)胞裂解液（SD-001），繼續(xù)研磨 30-60 次。（組織用量不要過(guò)量，無(wú)需過(guò)度研磨，裂解液可分兩次加入以得到最佳效果）注意：塑料研磨棒可以重復(fù)使用，用蒸餾水徹底沖洗干凈，用紙巾擦干。
天然總蛋白提�。⊿N-002）ELISA，IP，CO-IP，酶活性檢測(cè)等實(shí)驗(yàn)適用
常見(jiàn)問(wèn)題
3. 蓋上蓋子，室溫孵育 1-2 分鐘，14,000-16,000Xg 離心 1-2 分鐘。
4. 棄去離心管柱，收集管中即是蛋白樣品，可應(yīng)用于下游實(shí)驗(yàn)。
請(qǐng)注意：部分未完全裂解的組織不會(huì)影響樣品質(zhì)量。
天然總蛋白提�。⊿N-002）ELISA，IP，CO-IP，酶活性檢測(cè)等實(shí)驗(yàn)適用
1. 將離心管柱（filter cartridges）套入接收管中成為套管，與天然細(xì)胞裂解液（SN-002）共同放置于冰上預(yù)冷。
2. 將 15-20mg 新鮮/冷凍組織放置于離心管柱上，用塑料研磨棒向下按壓反復(fù)扭轉(zhuǎn)研磨 50-60 次，加入 200ul天然細(xì)胞裂解液（SN-002），繼續(xù)研磨 30-60 次。（組織用量不要過(guò)量，無(wú)需過(guò)度研磨，裂解液可分兩次加入以得到最佳效果）。注意：塑料研磨棒可以重復(fù)使用，用蒸餾水徹底沖洗干凈，用紙巾擦干。
3. 開(kāi)蓋冰上孵育 5 分鐘，蓋上蓋子，4℃，14,000-16,000Xg 離心 1-2 分鐘。
4. 棄去離心管柱，收集管中即是蛋白樣品，可應(yīng)用于下游實(shí)驗(yàn)
常見(jiàn)問(wèn)題
問(wèn)題 解決方案
裂解物太粘稠，無(wú)法用200-1000µL 吸頭吹打 將細(xì)胞裂解物倒入離心管柱中或?qū)⑽^剪掉尖端
離心 30 秒后離心柱上還存留細(xì)胞裂解物 減少起始細(xì)胞/組織的數(shù)量或增加細(xì)胞裂解液 低蛋白濃度 增加起始細(xì)胞/組織的數(shù)量或減少細(xì)胞裂解液量
高分子量范圍（100-300KDa）蛋白條帶弱 增加細(xì)胞裂解液量，確保細(xì)胞/組織裂解充分
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