講解細(xì)胞凍存實(shí)驗(yàn)步驟及注意事項(xiàng)
隨著溫度降低，細(xì)胞內(nèi)的酶活性會(huì)逐漸降低，到-70℃左右，酶活性幾乎為0，代謝活動(dòng)停止，可以實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)期保存。然而，隨著溫度降低，細(xì)胞內(nèi)外的水分也會(huì)“結(jié)冰”并形成冰晶，冰晶能導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)發(fā)生機(jī)械損傷、電解質(zhì)升高、滲透壓改變、脫水、pH改變、蛋白變性等，能引起細(xì)胞死亡。因此常加入冷凍保護(hù)劑甘油或二甲基亞砜（DMSO）。DMSO能快速穿透細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞，降低冰點(diǎn)，延緩凍存過(guò)程，同時(shí)增加細(xì)胞膜的通透性，提高細(xì)胞內(nèi)離子濃度，減少細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成，從而達(dá)到保護(hù)細(xì)胞的目的。
實(shí)驗(yàn)步驟：
1. 保持凍存前細(xì)胞狀態(tài)良好
凍存前一定要保證細(xì)胞狀態(tài)良好，細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，否則不管后面怎么處理，凍存后的細(xì)胞狀態(tài)必然有影響。若細(xì)胞密度偏高，培養(yǎng)基已經(jīng)略微變黃，細(xì)胞狀態(tài)正常，需要換液培養(yǎng)2h以上再凍存細(xì)胞；若已*變黃，細(xì)胞死亡超過(guò)20%，需要傳代后再重新培養(yǎng)至狀態(tài)正常后再凍存細(xì)胞。
2. 消化、吹打細(xì)胞按盡量輕柔
凍存后細(xì)胞培養(yǎng)瓶和培養(yǎng)皿肯定還是會(huì)殘留一點(diǎn)細(xì)胞，這些殘留的細(xì)胞加新的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，如果培養(yǎng)正常就可以看出凍存時(shí)消化、吹打操作是沒(méi)有問(wèn)題的，如果直接死了或者狀態(tài)不好，那凍存的細(xì)胞自然也好不到哪里去，問(wèn)題出在哪就很明顯了。
3. 凍存液配方要給合適的
凍存液配方這個(gè)其實(shí)不同實(shí)驗(yàn)室都有自己的習(xí)慣，有FBS+10%DMSO的，也有*培養(yǎng)基+10%DMSO的，還有基礎(chǔ)培養(yǎng)基+血清+DMSO=7:2:1 6:3:1 5:4:1，可以說(shuō)是五花八門，但總體來(lái)說(shuō)，DMSO一般是不超過(guò)12%的，血清濃度越高凍存效果也越好，因此需要多凍幾次對(duì)比合適的配方。
4. 凍存液要提前配置
凍存液使用時(shí)要提前配好，不能直接在細(xì)胞懸液中加DMSO凍存細(xì)胞，否則DMSO溶解時(shí)濃度不均加上溶解放熱會(huì)損傷細(xì)胞活性。可以現(xiàn)配先用，也可以多配一點(diǎn)，4度最多可以保存3個(gè)月，-20度可以保存一年。細(xì)胞用凍存液重懸后應(yīng)盡快放到4度或者程序性凍存盒開始凍存，避免長(zhǎng)時(shí)間室溫狀態(tài)，因?yàn)槭覝貤l件下DMSO對(duì)細(xì)胞是有害的。
5. 凍存細(xì)胞數(shù)量選擇
通常來(lái)說(shuō)，凍存細(xì)胞都會(huì)有一部分細(xì)胞死亡，所以凍存剩下的活細(xì)胞數(shù)量才是決定細(xì)胞復(fù)蘇后能否正常養(yǎng)起來(lái)的關(guān)鍵。一般凍存不容易死的細(xì)胞數(shù)量每管在100-200萬(wàn)就夠了，一些凍存很容易死的細(xì)胞，比如NK92、THP-1、SF9等細(xì)胞數(shù)量要稍微高點(diǎn)，300-400萬(wàn)左右為宜。凍存液一般1ml左右每管，這個(gè)基本每個(gè)實(shí)驗(yàn)室都差不多。
6. 凍存程序選擇
凍存的時(shí)候可以選擇用程序性凍存盒直接放到-80度凍存細(xì)胞，但要記得異丙醇要及時(shí)更換，一般用4-5次異丙醇含水量就超標(biāo)了，不再適合凍存細(xì)胞使用。也可以將凍存管依次在4度10min，-20度2h，-80過(guò)夜后液氮保存。-80度不適合細(xì)胞長(zhǎng)期保存，只能短期保存，最好不要超過(guò)一周，否則有部分細(xì)胞系活性可能會(huì)下降很厲害，長(zhǎng)期保存的細(xì)胞最好放液氮罐保存。
7. 注意凍存檢查
凍存細(xì)胞后應(yīng)在同一批次內(nèi)隨機(jī)選一只細(xì)胞復(fù)蘇檢測(cè)凍存效果， 如果復(fù)蘇效果不佳的話需要找到問(wèn)題所在摸索合適條件重新凍存細(xì)胞，如果復(fù)蘇良好的就可以放到液氮里長(zhǎng)期保存了。這個(gè)也是前面推薦將凍存剩下的細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)的原因，可以有效避免細(xì)胞凍存失敗導(dǎo)致絕種。
實(shí)驗(yàn)步驟：
1. 制備凍存液，凍存液比例：本實(shí)驗(yàn)室采用70%基礎(chǔ)培養(yǎng)基+20%FBS+10%DMSO，不同實(shí)驗(yàn)室及不同細(xì)胞可能略有差異，也可采用55%基礎(chǔ)培養(yǎng)基+40%FBS+5%DMSO；
2. 取形態(tài)良好，處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，對(duì)其消化、離心 (1500rpm離心8min)、計(jì)數(shù)；
3. 根據(jù)細(xì)胞數(shù)量加入對(duì)應(yīng)的凍存液，使細(xì)胞密度維持在300-500w/mL；
4. 小心用鑷子打開凍存管管蓋，每管分裝1-1.5mL含細(xì)胞的凍存液，擰緊蓋管，做好標(biāo)記。
5. 分裝好的凍存管轉(zhuǎn)入程序降溫盒后直接放-80℃過(guò)夜；
6. 若沒(méi)有程序降溫盒，則按下列順序依次降溫：室溫→4℃20min→-20℃30min→-80℃過(guò)夜，注意轉(zhuǎn)移過(guò)程中要保冷，避免產(chǎn)生溫差或凍存管融化；
7. 從-80℃冰箱取出凍存管迅速轉(zhuǎn)移到液氮長(zhǎng)期保存。
我們都知道，細(xì)胞如果要長(zhǎng)期保存，需要凍存起來(lái)放液氮保存。那怎么樣凍存細(xì)胞才能保證細(xì)胞能正常復(fù)蘇，不至于凍存死亡呢？下面我們就來(lái)講解細(xì)胞凍存應(yīng)該注意的一些地方。1. 保持凍存前細(xì)胞狀態(tài)良好
凍存前一定要保證細(xì)胞狀態(tài)良好，細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，否則不管后面怎么處理，凍存后的細(xì)胞狀態(tài)必然有影響。若細(xì)胞密度偏高，培養(yǎng)基已經(jīng)略微變黃，細(xì)胞狀態(tài)正常，需要換液培養(yǎng)2h以上再凍存細(xì)胞；若已*變黃，細(xì)胞死亡超過(guò)20%，需要傳代后再重新培養(yǎng)至狀態(tài)正常后再凍存細(xì)胞。
2. 消化、吹打細(xì)胞按盡量輕柔
凍存后細(xì)胞培養(yǎng)瓶和培養(yǎng)皿肯定還是會(huì)殘留一點(diǎn)細(xì)胞，這些殘留的細(xì)胞加新的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，如果培養(yǎng)正常就可以看出凍存時(shí)消化、吹打操作是沒(méi)有問(wèn)題的，如果直接死了或者狀態(tài)不好，那凍存的細(xì)胞自然也好不到哪里去，問(wèn)題出在哪就很明顯了。
3. 凍存液配方要給合適的
凍存液配方這個(gè)其實(shí)不同實(shí)驗(yàn)室都有自己的習(xí)慣，有FBS+10%DMSO的，也有*培養(yǎng)基+10%DMSO的，還有基礎(chǔ)培養(yǎng)基+血清+DMSO=7:2:1 6:3:1 5:4:1，可以說(shuō)是五花八門，但總體來(lái)說(shuō)，DMSO一般是不超過(guò)12%的，血清濃度越高凍存效果也越好，因此需要多凍幾次對(duì)比合適的配方。
4. 凍存液要提前配置
凍存液使用時(shí)要提前配好，不能直接在細(xì)胞懸液中加DMSO凍存細(xì)胞，否則DMSO溶解時(shí)濃度不均加上溶解放熱會(huì)損傷細(xì)胞活性。可以現(xiàn)配先用，也可以多配一點(diǎn)，4度最多可以保存3個(gè)月，-20度可以保存一年。細(xì)胞用凍存液重懸后應(yīng)盡快放到4度或者程序性凍存盒開始凍存，避免長(zhǎng)時(shí)間室溫狀態(tài)，因?yàn)槭覝貤l件下DMSO對(duì)細(xì)胞是有害的。
5. 凍存細(xì)胞數(shù)量選擇
通常來(lái)說(shuō)，凍存細(xì)胞都會(huì)有一部分細(xì)胞死亡，所以凍存剩下的活細(xì)胞數(shù)量才是決定細(xì)胞復(fù)蘇后能否正常養(yǎng)起來(lái)的關(guān)鍵。一般凍存不容易死的細(xì)胞數(shù)量每管在100-200萬(wàn)就夠了，一些凍存很容易死的細(xì)胞，比如NK92、THP-1、SF9等細(xì)胞數(shù)量要稍微高點(diǎn)，300-400萬(wàn)左右為宜。凍存液一般1ml左右每管，這個(gè)基本每個(gè)實(shí)驗(yàn)室都差不多。
6. 凍存程序選擇
凍存的時(shí)候可以選擇用程序性凍存盒直接放到-80度凍存細(xì)胞，但要記得異丙醇要及時(shí)更換，一般用4-5次異丙醇含水量就超標(biāo)了，不再適合凍存細(xì)胞使用。也可以將凍存管依次在4度10min，-20度2h，-80過(guò)夜后液氮保存。-80度不適合細(xì)胞長(zhǎng)期保存，只能短期保存，最好不要超過(guò)一周，否則有部分細(xì)胞系活性可能會(huì)下降很厲害，長(zhǎng)期保存的細(xì)胞最好放液氮罐保存。
7. 注意凍存檢查
凍存細(xì)胞后應(yīng)在同一批次內(nèi)隨機(jī)選一只細(xì)胞復(fù)蘇檢測(cè)凍存效果， 如果復(fù)蘇效果不佳的話需要找到問(wèn)題所在摸索合適條件重新凍存細(xì)胞，如果復(fù)蘇良好的就可以放到液氮里長(zhǎng)期保存了。這個(gè)也是前面推薦將凍存剩下的細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)的原因，可以有效避免細(xì)胞凍存失敗導(dǎo)致絕種。
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