1.熟練掌握小鼠膽管類器官原代建立技術(shù)。 

2.了解掌握小鼠多種組織來(lái)源類器官原代建立技術(shù)。 

3.觀察記錄小鼠膽管原代類器官生長(zhǎng)、擴(kuò)增過(guò)程中類器官形態(tài)的變化。

本實(shí)驗(yàn)策略采取從成體干細(xì)胞中建立和維持小鼠膽管類器官的方法。膽管上皮的自我更新是由位于肝臟的干細(xì)胞及其祖細(xì)胞的增殖所驅(qū)動(dòng)的。小鼠膽管類器官表達(dá)膽管上皮在結(jié)構(gòu)、細(xì)胞類型組成和自我更新動(dòng)力學(xué)方面的所有標(biāo)志，因此為小鼠肝臟發(fā)育和疾病的前所未有的研究提供了巨大的希望。 

1. 儀器：生物安全柜、細(xì)胞培養(yǎng)箱、低溫水平式離心機(jī)、倒置顯微鏡、低溫冰箱、搖床。

2. 材料：細(xì)胞培養(yǎng)板(規(guī)格為24孔、48孔和96孔)、離心管(規(guī)格為1.5mL、15mL和50mL)、細(xì)胞培養(yǎng)皿(直徑規(guī)格為2.5cm和6cm)、移液器(規(guī)格為2.5μL、10μL、20μL、200μL、1000μL和5000μL)、無(wú)菌吸頭(規(guī)格為10μL、200μL和1000μL)、無(wú)菌鑷子、無(wú)菌組織剪。

3.試劑：小鼠膽管類器官培養(yǎng)試劑盒(MA-0817H009HL/S)、組織消化液(MB-0818L06S-100)、潤(rùn)洗液(MB-0818L03L/S)、基礎(chǔ)培養(yǎng)基(MB-0818L07)、胎牛血清、DPBS、基質(zhì)膠(082701/082703/082755)、紅細(xì)胞裂解液(MB-0818L08L/S)。

■ 小鼠膽管類器官培養(yǎng)試劑盒(MA-0817H009HL/S)、基質(zhì)膠(082701/082703/082755)4℃化凍；

■ 小鼠膽管類器官完全培養(yǎng)基的制備：將200μL Mouse Liver Ductal Organoid Supplement B (50x)，40μL Mouse Liver Ductal Organoid Supplement C (250x) 加至9.76mL Mouse Liver Ductal Organoid Basal Medium中，充分混合，配制成10mL小鼠膽管類器官完全培養(yǎng)基，室溫平衡，可在2-8°C儲(chǔ)存，建議在兩周內(nèi)使用；

■ 準(zhǔn)備足量添加1%雙抗的DPBS；

■ 配制10mL組織消化液，現(xiàn)配現(xiàn)用，37℃搖床混勻預(yù)熱，未用完消化液可-20℃保存1周（Mogengel：10mL基礎(chǔ)液+添加物500μL)。

小鼠斷脊處死，表面噴灑酒精殺菌，在無(wú)菌條件下將膽管第一大肝葉取出，用刀片切下1/2肝葉，放入4℃預(yù)冷的DPBS溶液中。

用冰冷的DPBS清洗2~3次，將組織轉(zhuǎn)移到新的6cm培養(yǎng)皿或1.5mL EP管中，用無(wú)菌組織剪將組織剪成約0.5mm³的碎片。

將剪碎的組織轉(zhuǎn)移到15mL離心管中，并加入約10mL冰冷的Basal medium。用5mL移液管上下吹打樣品，以去除紅血球和脂肪(它們會(huì)漂浮到溶液的頂部)。后讓組織碎片沉降5~7分鐘，并棄去約7.5mL的上清液，包括任何漂浮的脂肪， 后重復(fù)此洗滌步驟1~2次。

將剪碎的組織用適量的原代組織液消化液(MB-0818L06S-100)重懸，并轉(zhuǎn)移至新的離心管內(nèi)，于37℃，100rpm條件下的恒溫振蕩培養(yǎng)箱中，消化20-30分鐘，每隔10分鐘觀察組織消化情況，待組織塊明顯分散，懸液較渾濁時(shí)，取適量組織消化懸液鏡檢，待懸液中有較多膽管結(jié)構(gòu)即可終止消化，若組織碎塊較大或消化不完全可適當(dāng)延長(zhǎng)消化時(shí)間。消化期間可以使用不同規(guī)格的移液器吹打組織消化懸液，幫助充分消化。 

在消化完成的組織懸液中加入胎牛血清（Fetal Bovine Serum, FBS）至終濃度達(dá)1%~5%以減緩消化作用，同時(shí)輕輕吹打5~10次。 

靜置3-10min，待組織碎片自然沉降后，將上清液轉(zhuǎn)移至新的15mL離心管中，剩余組織碎片中加入1mL冰冷的Basal medium吹打5~10次，靜置1min待組織碎片自然沉降后，將上清收集至離心管中。在8℃下以250g的速度離心3min，棄去上清以洗去殘留的消化液。若所獲細(xì)胞沉淀呈紅色，說(shuō)明其中包含紅細(xì)胞，則需在清洗前于沉淀中加入紅細(xì)胞裂解液(MB-0818L08L/S)裂解紅細(xì)胞，并于250g離心力離心3分鐘，吸去上清液保留沉淀，再對(duì)沉淀進(jìn)行清洗。

用含有抗生素的PBS或基礎(chǔ)培養(yǎng)基(MB-0818L07)清洗細(xì)胞2次（混勻后250g離心力離心，3分鐘，棄去上清液）以除去FBS。 

將清洗后的細(xì)胞沉淀用含有抗生素的PBS或基礎(chǔ)培養(yǎng)基重懸，取少量懸液進(jìn)行活細(xì)胞檢測(cè)和計(jì)數(shù)，并按照100,000~500,000個(gè)細(xì)胞/mL的密度加入細(xì)胞外基質(zhì)（>70%）并在冰上混勻，混勻后置于冰上。

注意：混勻吹打的動(dòng)作要輕柔，切忌產(chǎn)生大量氣泡，常溫混勻則需要控制在15秒內(nèi)。

用移液器吸取細(xì)胞外基質(zhì)和細(xì)胞的混合液移至細(xì)胞培養(yǎng)孔板中，（如24孔細(xì)胞培養(yǎng)板每孔點(diǎn)20~30μL混合懸液，48孔板每孔點(diǎn)12.5~18μL混合懸液，96孔板孔板每孔點(diǎn)3~5μL混合懸液），混合懸液須點(diǎn)至培養(yǎng)孔底部中央位置，其鋪開(kāi)后不可接觸培養(yǎng)孔側(cè)壁。將培養(yǎng)板放入37℃，在5%CO₂細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育20分鐘，待細(xì)胞外基質(zhì)凝固至不再流動(dòng)后，沿孔壁緩緩加入完全培養(yǎng)基，(如24孔板加500μL完全培養(yǎng)基，48孔板加250μL完全培養(yǎng)基，96孔板加100μL完全培養(yǎng)基)，P0代培養(yǎng)3~4天換液。 

將細(xì)胞培養(yǎng)板放入培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，每1天于倒置顯微鏡下觀察類器官的生長(zhǎng)狀態(tài)，每3天于倒置顯微鏡下拍照，記錄多個(gè)視野中的類器官的形態(tài)和分布。

五、小鼠膽管類器官培養(yǎng)推薦試劑