Q1：線性mRNA各組件概念及功能?

 

A1：（1）5’-Cap：通常作為mRNA的起始結(jié)構(gòu)，帽子結(jié)構(gòu)可以使得mRNA進(jìn)入體內(nèi)以后開(kāi)始翻譯，并維持mRNA的穩(wěn)定性。
 

（2）UTR(Untranslated Regions)：即非翻譯區(qū)，是mRNA分子兩端的非編碼片段。5'-UTR從mRNA起點(diǎn)的甲基化鳥(niǎo)嘌呤核苷酸帽延伸至AUG起始密碼子，3'-UTR從編碼區(qū)末端的終止密碼子延伸至多聚A尾巴(Poly-A)的前端。5'-UTR，可以提高mRNA在體內(nèi)翻譯的效率；3'-UTR,可以提高mRNA的翻譯效率。
 

（3）CDS序列(Coding sequences)：一般可以在NCBI上查到，是與蛋白區(qū)域一一對(duì)應(yīng)的序列，并且序列中間不存在其他與蛋白無(wú)關(guān)的序列，和真實(shí)情況最為接近。不同物種的CDS序列有一定的偏好性，因此，對(duì)CDS區(qū)域進(jìn)行廣泛的篩選和設(shè)計(jì)顯得尤為關(guān)鍵，優(yōu)化的CDS區(qū)域不僅可以提高mRNA的翻譯效率，同時(shí)修飾堿基的使用，可以進(jìn)一步的降低mRNA在體內(nèi)的免疫原性，增強(qiáng)藥物表現(xiàn)。開(kāi)放閱讀框ORF(Open reading frame)它是理論上的蛋白編碼區(qū)，一般是先在序列中尋找起始密碼子(AUG)對(duì)應(yīng)的序列ATG，然后按每3個(gè)堿基一組向后延伸，一直到出現(xiàn)終止密碼子(UAG、UGA、UAA)對(duì)應(yīng)的序列。
 

（4）Poly(A)tail：進(jìn)一步提高mRNA的穩(wěn)定性，提高mRNA的翻譯效率。

 

Q2：環(huán)狀RNA中IRES結(jié)構(gòu)及功能？

圖2 環(huán)狀mRNA結(jié)構(gòu)示例

 

A2：IRES為核糖體的結(jié)合位點(diǎn)，該結(jié)構(gòu)可啟動(dòng)環(huán)狀mRNA的翻譯，它跟線性mRNA的帽結(jié)構(gòu)類(lèi)似。IRES避免了環(huán)狀mRNA必須添加昂貴的5’端帽子和繁瑣的Poly(A)尾巴。

 

Q3：環(huán)狀RNA環(huán)化的方式是什么？

A3：參考Anderson發(fā)表的文章，本公司環(huán)狀mRNA環(huán)化的方式是添加同源臂內(nèi)含子自剪切方式。

 

Q4：線性mRNA中5種修飾堿基各有什么區(qū)別和作用？

A4：不同核苷酸修飾表現(xiàn)出不同的功能和作用,其中假尿苷修飾和甲基假尿苷修飾是應(yīng)用最為廣泛的,具體選擇哪一種修飾應(yīng)當(dāng)根據(jù)實(shí)驗(yàn)確定。
 

（1）Pseudo-UTP(Ψ)假尿苷：改變密碼子、增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄本穩(wěn)定性和應(yīng)激反應(yīng)應(yīng)答。降低mRNA免疫原性,提高mRNA穩(wěn)定性并增強(qiáng)其翻譯能力；
 

（2）N1-Methylpseudo-UTP(mΨ)甲基假尿苷：通過(guò)增加核糖體密度以elF2α依賴(lài)性和獨(dú)立機(jī)制增強(qiáng)翻譯,比假尿苷修飾更能降低mRNA免疫原性,并可增強(qiáng)mRNA的蛋白表達(dá)能力；
 

（3）N6-Methyl-ATP(m6A)：與mRNA穩(wěn)定性、剪接加工以及microRNA 加工有關(guān),可促進(jìn)mRNA翻譯；
 

（4）5-Methyl-CTP(5mC)：5mC修飾連同多種效應(yīng)酶,執(zhí)行多種功能; 5mC的分布因細(xì)胞類(lèi)型而異,在mRNA特定位置上的5mC修飾表現(xiàn)出不同的調(diào)控活性:它們可以促進(jìn)或抑制翻譯；
 

（5）5-Methoxy-UTP(5moU)：可以降低所得mRNA的免疫原性,促進(jìn)蛋白表達(dá),對(duì)炎性巨噬細(xì)胞反應(yīng)的誘導(dǎo)可忽略不計(jì)。

 

Q5：修飾堿基、帽結(jié)構(gòu)一般推薦什么或者通用的是什么？

A5：我司一般用N1-甲基-假尿苷(N1-Methylpseudo-UTP)修飾堿基進(jìn)行合成產(chǎn)品。通用帽結(jié)構(gòu)采用的是Cap1 AG（化學(xué)共轉(zhuǎn)錄法加帽），客戶(hù)若有附加質(zhì)控，我們可提供Cap ratio檢測(cè)。

 
Q6：Fluc mRNA表達(dá)的是什么熒光素？

A6：FLuc mRNA表達(dá)了一個(gè)最初從螢火蟲(chóng)中提取的螢光素酶蛋白，可以催化螢火蟲(chóng)螢光素D-Luciferin氧化成發(fā)光物質(zhì)，發(fā)出黃綠色螢光。

Q7：Fluc-mRNA帶cy5熒光標(biāo)記的，做實(shí)驗(yàn)的時(shí)候需要避光嗎？

A7：最好將Fluc-mRNA進(jìn)行避光實(shí)驗(yàn)操作、避光保存，因?yàn)橐�防止熒光淬滅影響�?shí)驗(yàn)結(jié)果。

Q8：mRNA保存條件是什么？

A8：需要低于-40°C保存，-80℃冰箱或液氮保存都可以，愛(ài)必信所提供的均為新鮮生產(chǎn)的產(chǎn)品，為了達(dá)到最佳使用效果，請(qǐng)?jiān)谑盏截浳锏?個(gè)月內(nèi)使用。若不小心將mRNA短期（例如1天）存放于-20℃，可以在正式實(shí)驗(yàn)之前將mRNA跑瓊脂糖凝膠電泳看其是否降解。

Q9：mRNA未添加帽結(jié)構(gòu)一般可以存放多久呢？

A9：mRNA添加了加帽結(jié)構(gòu)我們建議可以-40℃保存2個(gè)月，未加帽的mRNA需要盡快使用，因?yàn)槲刺砑用苯Y(jié)構(gòu)的mRNA穩(wěn)定性會(huì)降低，mRNA會(huì)受到核酸外切酶的降解。 

Q10：mRNA保存液主要有哪幾種？有什么區(qū)別？

A10：我司的mRNA保存溶劑主要有檸檬酸鈉鹽溶液和無(wú)核酸酶水兩種。檸檬酸鈉鹽溶液更適合動(dòng)物體內(nèi)的生理環(huán)境，如果是注射動(dòng)物可以選擇用檸檬酸鈉鹽溶液保存mRNA；如果是mRNA做包裹后推薦使用無(wú)核酸酶水進(jìn)行保存；如果是做細(xì)胞處理實(shí)驗(yàn)，無(wú)核酸酶水及檸檬酸鈉鹽溶液都可以選擇，任選其一即可。

Q11：工具RNA的溶劑是什么？

A11：我司的工具mRNA通用溶劑一般是1mM檸檬酸鈉鹽溶液，pH為6.4。