鸚鵡熱衣原體的生物學(xué)性狀及鑒定與檢測方法
瀏覽次數(shù):831 發(fā)布日期:2023-6-15
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鸚鵡熱衣原體屬于衣原體目(Chlamydiales)、衣原體科(Chlamydiaceae)、衣原體屬(Chlamydia)中的一種微生物,嚴(yán)格細(xì)胞內(nèi)寄生。最初認(rèn)為鸚鵡是該病原體的宿主而將其引起的疾病稱為鸚鵡熱(psittacosis),又名鳥疫(ornithosis)。
一、生物學(xué)性狀
1、基本形態(tài)
鸚鵡熱衣原體為革蘭氏陰性,光學(xué)顯微鏡下可見,比細(xì)菌小比病毒大,直徑0.3μm、0.4μm。細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)和成分與其他革蘭氏陰性菌相似,但沒有或有微量胞壁酸,細(xì)胞壁上有屬特異脂多糖抗原。細(xì)胞質(zhì)中有DNA和RNA,并有不完全的酶系統(tǒng),在宿主細(xì)胞質(zhì)的空泡內(nèi)增生,具有特異性包涵體。
2、培養(yǎng)特性和生化特性
衣原體的人工培養(yǎng)可通過雞胚、乳鼠和組織培養(yǎng)等方法。將衣原體接種6~8d齡雞胚卵黃囊中,36~37℃孵育5~6d,雞胚死亡。可見到卵黃膜充血,易剝離,絨毛尿囊膜水腫.部分胚體有小出血點(diǎn)。卵黃囊膜涂片有多量的衣原體原體。有時(shí)可在細(xì)胞漿中見到包涵體。將衣原體感染的雞胚卵黃囊保存于−70℃環(huán)境下,衣原體至少可存活10年以上。
此外也能在McCoy細(xì)胞、鼠L細(xì)胞、Hela細(xì)胞、Vero細(xì)胞、BHK21細(xì)胞、BGM細(xì)胞、Chang氏人肝細(xì)胞內(nèi)生長繁殖。離心或用X線照射細(xì)胞,可使更多的衣原體吸附到易感細(xì)胞表面而提高細(xì)胞培養(yǎng)陽性率。鸚鵡熱衣原體經(jīng)腹腔接種,性病淋巴肉芽腫衣原體腦內(nèi)接種可使小白鼠感染。
鸚鵡熱衣原體有獨(dú)特的發(fā)育周期,具有原體(elementary body,EB)和網(wǎng)狀體(reticular body,RB)2個(gè)發(fā)育階段。
原體(感染相),存在于細(xì)胞外,形體較小,呈球形,直徑0.2~0.4μm,姬姆薩氏染色呈紫色,馬基維羅氏染色呈紅色。原體不具有生物活性,但可以抵抗環(huán)境壓力,可以在宿主體外存活。
網(wǎng)狀體,又稱始體(initial body,IB),呈圓形或不規(guī)則形,結(jié)構(gòu)疏松,直徑0.7~1.5μm,姬姆薩氏染色和馬基維羅氏染色均呈藍(lán)色。網(wǎng)狀體由原體進(jìn)入細(xì)胞漿后發(fā)育增大形成,是衣原體新陳代謝活化的表現(xiàn),可利用宿主細(xì)胞機(jī)能,通過二分裂方式反復(fù)分裂生成新一代原體,在宿主細(xì)胞漿內(nèi)形成包涵體,此時(shí)無傳染性。隨宿主細(xì)胞破裂,存在于包涵體內(nèi)的原體可從細(xì)胞漿內(nèi)釋放出來,再感染其他細(xì)胞,開始新的發(fā)育周期,整個(gè)發(fā)育周期需48~72h。
鸚鵡熱衣原體對理化因素抵抗力不強(qiáng)。在70%酒精、2%來蘇水、2%氫氧化鈉、1%鹽酸、3%過氧化氫及硝酸溶液中數(shù)分鐘內(nèi)可失去感染力。0.5%石炭酸、0.1%福爾馬林于24h內(nèi)可將其殺死。耐冷不耐熱,56℃5min,37℃48h可滅活,但−70℃環(huán)境可存活數(shù)年。外界干燥的條件下可存活5周。在室溫和日光下最多能存活6d,紫外線對衣原體有很強(qiáng)的殺滅作用。在水中可存活17d。四環(huán)素、氯霉素和紅霉素等抗生素有抑制其繁殖作用。
3、毒性
鸚鵡衣原體可在其眾多宿主動(dòng)物中引起廣譜疾病,典型臨床表現(xiàn)為高熱、惡寒、頭痛、肌痛、咳嗽和肺部浸潤性病變等特征。一般癥狀頗似感冒或呼吸道感染,但多見發(fā)生肺炎,易于誤診。
二、鑒定及檢測方法
依病禽、鳥等臨床上出現(xiàn)精神萎頓、結(jié)膜炎、脫水、消瘦、極度衰竭呈惡病質(zhì)和排出綠色膠凍狀糞便,可作出初步判斷。剖檢發(fā)現(xiàn)脾、肝腫大,纖維素性氣囊炎,心包炎和腹膜炎,肺充血,腸管充血,則需進(jìn)一步進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室診斷。
我國對嗜衣原體的檢測方法主要有病原學(xué)檢查、血清學(xué)檢測和分子生物學(xué)檢測。
(一)病原學(xué)檢查
病原學(xué)檢查是確診的重要方法,包括顯微鏡檢查和細(xì)胞培養(yǎng)法。病原學(xué)檢查陽性率不高(20%左右),需一定的技術(shù)及設(shè)備條件,同時(shí)應(yīng)注意實(shí)驗(yàn)室污染。
1、顯微鏡檢查法
無菌采集患者及病鳥、畜的生物材料,包括血液、病變臟器、流產(chǎn)胎兒及各種分泌物制片。將所采病料(肝、肺、脾)表面火焰消毒后,從其內(nèi)部無菌取樣,涂片,用Giemsa染色,可見EB呈現(xiàn)紅色,RB呈藍(lán)紫色。用Stamp氏法染色,結(jié)果是在淡綠色背景的襯托下,衣原體呈現(xiàn)鮮紅色。碘染色(Rice)法時(shí),低倍鏡下,沙眼衣原體的包涵體由于含有糖原而呈現(xiàn)棕褐色,鸚鵡熱衣原體的包涵體由于不含有糖原不被著色。在熒光顯微鏡下檢查,可見亮綠色邊界清晰的圓形顆粒,柱狀細(xì)胞內(nèi)可見亮綠色包涵體。電鏡下,可以見到圓形或卵圓形顆粒,中央核心電子密度大,是EB;個(gè)體較大,中央核心電子密度低的為RB。
2、細(xì)胞培養(yǎng)法
常見有兩種方法,一種是利用HeLa229細(xì)胞或McCoy細(xì)胞等進(jìn)行分離培養(yǎng),另一種則是通過雞胚卵黃囊接種培養(yǎng),隨后均經(jīng)過姬姆薩染色或熒光染色,最終利用顯微鏡鑒定包涵體。
細(xì)胞分離培養(yǎng)一直被視為衣原體檢測的標(biāo)準(zhǔn)方法。該法的敏感性顯著高于雞胚培養(yǎng)法,而且某標(biāo)本接種細(xì)胞的盲傳培養(yǎng)可提高分離率。衣原體可在多種細(xì)胞中增殖、分離或培養(yǎng)最常用是McCoy和L929細(xì)胞。其他傳代細(xì)胞如BHK21、LF、Vero等傳代細(xì)胞均可供選用。用熒光標(biāo)記的抗體、酶結(jié)合的單克隆抗體、碘或姬姆薩氏染色,胞漿中若出現(xiàn)特征性的包涵體,即可考慮存在衣原體。
由于絕大多數(shù)衣原體可在5~9d齡雞胚卵黃囊內(nèi)生長繁殖,雞胚卵黃囊接種培養(yǎng)接種用的病料應(yīng)預(yù)先用滅菌肉湯或Hank’s液制成10%的組織懸液,如有雜菌,需在懸液中加入鏈霉素(50mg/ml)和慶大霉素(50mg/ml),4℃下作用4~14h后,離心取上清液接種雞胚卵黃囊,每胚0.3~0.5ml。繼續(xù)培養(yǎng),棄去前2d死亡的雞胚。一般于接種后5~12d死亡,將死亡雞逐漸形成的卵黃囊自雞胚割離。并將其剪破,無菌生理鹽水沖洗卵黃囊膜,除去卵黃,夾取卵黃囊膜一小塊涂片,染色鏡檢。
細(xì)胞培養(yǎng)不利的一方面是必需有可以被檢測的感染組織或器官,這就要求采樣后要及時(shí)送到實(shí)驗(yàn)室,運(yùn)輸媒介要合適,不能混有青霉素,保持4℃或者液氮冷凍。
(二)血清學(xué)檢測
農(nóng)業(yè)部在2002年8月發(fā)布了農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《動(dòng)物衣原體病診斷技術(shù)》,標(biāo)準(zhǔn)號(hào)為NT/T562—2002,并于2002年12月1日正式實(shí)施。標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定了鸚鵡熱衣原體病主要采用:①補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)(CF)的直接法與間接法;②間接血凝試驗(yàn)(IHA)技術(shù)。另外,在實(shí)際工作中,ELISA實(shí)驗(yàn)也廣泛用于臨床診斷。
微量免疫熒光法(MIF)是國際上標(biāo)準(zhǔn)的且是最常用的衣原體血清學(xué)診斷方法,但在鸚鵡熱衣原體做診斷時(shí)應(yīng)謹(jǐn)慎,除病人具有病鳥接觸史以外,血清標(biāo)本應(yīng)同時(shí)檢測沙眼衣原體、肺炎衣原體和鸚鵡熱衣原體抗體并比較抗體滴度,以滴度最高作為感染的衣原體種,從而確定是否是鸚鵡熱衣原體,這三個(gè)衣原體種之間可能存在血清學(xué)交叉反應(yīng)。
(三)分子生物學(xué)檢測
分子生物學(xué)檢測體系是以基因檢測為基礎(chǔ),通過對病原體特定基因的分析對該病原體進(jìn)行定性乃至定量分析的一種檢測體系。核酸雜交是最早應(yīng)用于衣原體診斷的分子生物學(xué)方法;赑CR原理的基因檢測技術(shù)由于特異性好、敏感性高,則逐漸成為衣原體分子生物學(xué)診斷的主流方法。
國外學(xué)者已成功建立以衣原體的外膜蛋白基因(MOMP、ompA、ompB)、熱休克蛋白、脂多糖基因?yàn)榘谢虻腜CR檢測技術(shù)。其中有普通PCR檢測、多重PCR、RFLP-PCR分析和PCR-ELISA和Real-TimePCR。SYBR Green標(biāo)記與TaqMan探針最常用于Real-timePCR檢測中,檢測靶基因較多采用具有高度種屬特異性的衣原體外膜主蛋白MOMP基因。在臨床檢測中,與傳統(tǒng)的免疫熒光組化分析相比,Real-time PCR表現(xiàn)出較高的特異性,并且其檢測敏感性能達(dá)到10-1CFU相當(dāng)?shù)乃剑沟肦eal-timePCR有望成為C.psittaci臨床檢測的一個(gè)快速、可靠的方法。
鸚鵡熱衣原體的鑒定還可以根據(jù)鸚鵡熱衣原體對四環(huán)素族抗生素、紅霉素及螺旋霉素敏感,對慶大霉素、卡那霉素、新霉素、鏈霉素和磺胺嘧啶鈉不敏感的特性進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。
三、環(huán)境與污染源
含鸚鵡熱衣原體的分泌物、排泄物、羽毛及塵埃等可污染環(huán)境。禽類及其養(yǎng)殖場、宰殺車間、羽絨加工廠、家禽和鳥類市場或其集散點(diǎn)、轉(zhuǎn)運(yùn)場地或運(yùn)輸工具乃至信鴿調(diào)教基地等均可能成為傳染場所。帶菌或發(fā)病的鳥類、家禽、野生水鳥、外觀健康但排菌的鸚鵡、金絲雀等觀賞鳥類是重要的傳染源。城鄉(xiāng)常見的鴿群可能是具有廣泛地區(qū)性的傳染源。帶菌患者咯痰對他人也有傳染性。此外患病流產(chǎn)的牛、羊、豬等也是傳染源。
家禽感染與人群發(fā)病關(guān)系的調(diào)查顯示,鴨類多是東歐和俄羅斯人群間的傳染源,火雞次之;美國的人群感染主要來自火雞;西歐各地則以觀賞鳥類中鵝鵡為主,其他如金絲雀及鴿等也是常見的傳染源,偶有從海鳥獲得感染的。