ELISA實(shí)驗(yàn)常用樣本采集和處理的方式詳解
酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（enzyme linked immunosorbent assay，簡(jiǎn)寫ELISA）指將可溶性的抗原或抗體結(jié)合到聚苯乙烯等固相載體上，利用抗原抗體特異性結(jié)合進(jìn)行免疫反應(yīng)的定性和定量檢測(cè)方法。ELISA 實(shí)驗(yàn)的樣本種類很多，有血清，血漿，細(xì)胞裂解液，細(xì)胞培養(yǎng)上清，尿液，肺泡灌洗液，腦脊液，各種組織勻漿等，每種樣本采集和處理的方式都不相同。通過(guò)整理出以下方法僅供參考。
一、血清
1、采血后室溫靜置20min或更長(zhǎng)時(shí)間至血清析出。
2、將采集的血液用離心機(jī)4℃，2000rpm離心15min左右，將離心好的勻漿小心收集上清，棄下面沉淀。
3、取上清并分裝保存?zhèn)溆�，保存過(guò)程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。
大部分ELISA檢測(cè)均以血清為標(biāo)本。血清標(biāo)本可按常規(guī)方法采集，應(yīng)注意避免溶血，紅細(xì)胞溶解時(shí)會(huì)釋放出具有過(guò)氧化物酶活性的物質(zhì)，以HRP為標(biāo)記的 ELISA測(cè)定中，溶血標(biāo)本可能會(huì)增加非特異性顯色。此外還應(yīng)避免細(xì)菌污染，因?yàn)榫w中可能含有含有內(nèi)源性HRP，也會(huì)產(chǎn)生假陽(yáng)性反應(yīng)。血清標(biāo)本宜在新鮮時(shí)檢測(cè)。如在冰箱中保存過(guò)久，在間接法ELISA中可使本底加深。
二、血漿
1、取血后加入抗凝劑（EDTA、草酸鈉、肝素、枸櫞酸鈉等），混合10-20分鐘后，30分鐘內(nèi)于冰上分離血漿以減少血小板的污染（也可以直接用抗凝管采集）。
2、將采集血液用離心機(jī)4℃，2000rpm離心15min左右，將離心好的勻漿小心收集上清，棄下面沉淀。
3、取上清并分裝保存?zhèn)溆茫４孢^(guò)程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。
注意事項(xiàng)：制備血漿標(biāo)本需借助于抗凝劑EDTA,抗凝不完全的標(biāo)本因纖維蛋白原干擾而造成假陽(yáng)性。請(qǐng)注意指標(biāo)說(shuō)明書上對(duì)于抗凝血?jiǎng)┦欠裼刑厥庖螅ㄗh使用EDTA。血漿中除尚含有纖維蛋白原和抗凝劑外，其他成份均同等于血清。
三、尿液
1、采集尿液樣本500ul，加入無(wú)菌試管中。
2、用離心機(jī)4℃，2000rpm離心15min左右，將離心好的樣本小心收集上清，棄下面沉淀。
3、取上清并分裝保存?zhèn)溆茫４孢^(guò)程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。
四、細(xì)胞培養(yǎng)上清
1、用無(wú)菌試管收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液。
2、用離心機(jī)4℃，2000rpm離心15min左右，將離心好的勻漿小心收集上清，棄下面沉淀。
3、取上清并分裝保存?zhèn)溆�，保存過(guò)程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。
五、細(xì)胞裂解液
1、取細(xì)胞培養(yǎng)板或細(xì)胞懸液，用PBS（PH7.2-7.4）洗滌細(xì)胞培養(yǎng)板1-2次。
2、通過(guò)反復(fù)凍融或加入組織蛋白萃取試劑（裂解液），使細(xì)胞破壞并放出細(xì)胞內(nèi)成份。
3、用離心機(jī)4℃，2000rpm離心20min左右，將離心好的勻漿小心收集上清，棄下面沉淀。
4、取上清并分裝保存?zhèn)溆�，保存過(guò)程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。
六、 組織勻漿
1、采集組織，在冰冷的生理鹽水中漂洗，除去血液，濾紙拭干，稱重，剔除附屬的結(jié)締組織，稱取組織塊。
2、用移液管量取0.1M PBS或者用0.86％冷生理鹽水，勻漿介質(zhì)或生理鹽水的體積總量應(yīng)該是組織塊重量的9倍，用眼科小剪盡快剪碎組織塊（天熱時(shí)操作要在冰水浴中進(jìn)行，將盛有組織的小燒杯放入冰水中）。
3、勻漿的方式有多種：
a) 手工勻漿：將剪碎的組織倒入玻璃勻漿管中，再將剩余的1/3勻漿介質(zhì)或生理鹽水沖洗殘留在燒杯中的碎組織塊，一起倒入勻漿管中進(jìn)行勻漿，左手持勻漿管將下端插入盛有冰水混合物的器皿中，右手將搗桿垂直插入套管中，上下轉(zhuǎn)動(dòng)研磨數(shù)十次（6～8分鐘），充分研碎，使組織勻漿化。
b)、機(jī)器勻漿：用組織搗碎機(jī)10000～15000r/min上下研磨制成10％組織勻漿，也可用內(nèi)切式組織勻漿機(jī)制備（勻漿時(shí)間10秒/次，間隙30秒，連續(xù)3～5次，在冰水中進(jìn)行），皮膚、肌肉組織等可延長(zhǎng)勻漿時(shí)間。
c)、超聲粉碎：用超聲粉碎機(jī)進(jìn)行粉碎，可用Soniprep150型超聲波發(fā)生器以振幅14微米超聲處理30秒使細(xì)胞破碎，也可用國(guó)產(chǎn)超聲波發(fā)生儀，用40安培，5秒/次，間隙10秒反復(fù)3～5次。
4、將制備好的10％勻漿用離心機(jī)4℃，3000rpm離心15min，將離心好的勻漿小心收集上清，棄下面沉淀。
5、取上清并分裝保存?zhèn)溆�，保存過(guò)程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。
保存時(shí)間：
一般ELISA檢測(cè)樣本在2-8℃下，可放置保存24-48小時(shí)；-20℃下，可放置保存1個(gè)月；-70℃下，可放置保存6個(gè)月。
一、血清
1、采血后室溫靜置20min或更長(zhǎng)時(shí)間至血清析出。
2、將采集的血液用離心機(jī)4℃，2000rpm離心15min左右，將離心好的勻漿小心收集上清，棄下面沉淀。
3、取上清并分裝保存?zhèn)溆�，保存過(guò)程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。
大部分ELISA檢測(cè)均以血清為標(biāo)本。血清標(biāo)本可按常規(guī)方法采集，應(yīng)注意避免溶血，紅細(xì)胞溶解時(shí)會(huì)釋放出具有過(guò)氧化物酶活性的物質(zhì)，以HRP為標(biāo)記的 ELISA測(cè)定中，溶血標(biāo)本可能會(huì)增加非特異性顯色。此外還應(yīng)避免細(xì)菌污染，因?yàn)榫w中可能含有含有內(nèi)源性HRP，也會(huì)產(chǎn)生假陽(yáng)性反應(yīng)。血清標(biāo)本宜在新鮮時(shí)檢測(cè)。如在冰箱中保存過(guò)久，在間接法ELISA中可使本底加深。
二、血漿
1、取血后加入抗凝劑（EDTA、草酸鈉、肝素、枸櫞酸鈉等），混合10-20分鐘后，30分鐘內(nèi)于冰上分離血漿以減少血小板的污染（也可以直接用抗凝管采集）。
2、將采集血液用離心機(jī)4℃，2000rpm離心15min左右，將離心好的勻漿小心收集上清，棄下面沉淀。
3、取上清并分裝保存?zhèn)溆茫４孢^(guò)程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。
注意事項(xiàng)：制備血漿標(biāo)本需借助于抗凝劑EDTA,抗凝不完全的標(biāo)本因纖維蛋白原干擾而造成假陽(yáng)性。請(qǐng)注意指標(biāo)說(shuō)明書上對(duì)于抗凝血?jiǎng)┦欠裼刑厥庖螅ㄗh使用EDTA。血漿中除尚含有纖維蛋白原和抗凝劑外，其他成份均同等于血清。
三、尿液
1、采集尿液樣本500ul，加入無(wú)菌試管中。
2、用離心機(jī)4℃，2000rpm離心15min左右，將離心好的樣本小心收集上清，棄下面沉淀。
3、取上清并分裝保存?zhèn)溆茫４孢^(guò)程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。
四、細(xì)胞培養(yǎng)上清
1、用無(wú)菌試管收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液。
2、用離心機(jī)4℃，2000rpm離心15min左右，將離心好的勻漿小心收集上清，棄下面沉淀。
3、取上清并分裝保存?zhèn)溆�，保存過(guò)程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。
五、細(xì)胞裂解液
1、取細(xì)胞培養(yǎng)板或細(xì)胞懸液，用PBS（PH7.2-7.4）洗滌細(xì)胞培養(yǎng)板1-2次。
2、通過(guò)反復(fù)凍融或加入組織蛋白萃取試劑（裂解液），使細(xì)胞破壞并放出細(xì)胞內(nèi)成份。
3、用離心機(jī)4℃，2000rpm離心20min左右，將離心好的勻漿小心收集上清，棄下面沉淀。
4、取上清并分裝保存?zhèn)溆�，保存過(guò)程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。
六、 組織勻漿
1、采集組織，在冰冷的生理鹽水中漂洗，除去血液，濾紙拭干，稱重，剔除附屬的結(jié)締組織，稱取組織塊。
2、用移液管量取0.1M PBS或者用0.86％冷生理鹽水，勻漿介質(zhì)或生理鹽水的體積總量應(yīng)該是組織塊重量的9倍，用眼科小剪盡快剪碎組織塊（天熱時(shí)操作要在冰水浴中進(jìn)行，將盛有組織的小燒杯放入冰水中）。
3、勻漿的方式有多種：
a) 手工勻漿：將剪碎的組織倒入玻璃勻漿管中，再將剩余的1/3勻漿介質(zhì)或生理鹽水沖洗殘留在燒杯中的碎組織塊，一起倒入勻漿管中進(jìn)行勻漿，左手持勻漿管將下端插入盛有冰水混合物的器皿中，右手將搗桿垂直插入套管中，上下轉(zhuǎn)動(dòng)研磨數(shù)十次（6～8分鐘），充分研碎，使組織勻漿化。
b)、機(jī)器勻漿：用組織搗碎機(jī)10000～15000r/min上下研磨制成10％組織勻漿，也可用內(nèi)切式組織勻漿機(jī)制備（勻漿時(shí)間10秒/次，間隙30秒，連續(xù)3～5次，在冰水中進(jìn)行），皮膚、肌肉組織等可延長(zhǎng)勻漿時(shí)間。
c)、超聲粉碎：用超聲粉碎機(jī)進(jìn)行粉碎，可用Soniprep150型超聲波發(fā)生器以振幅14微米超聲處理30秒使細(xì)胞破碎，也可用國(guó)產(chǎn)超聲波發(fā)生儀，用40安培，5秒/次，間隙10秒反復(fù)3～5次。
4、將制備好的10％勻漿用離心機(jī)4℃，3000rpm離心15min，將離心好的勻漿小心收集上清，棄下面沉淀。
5、取上清并分裝保存?zhèn)溆�，保存過(guò)程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。
保存時(shí)間：
一般ELISA檢測(cè)樣本在2-8℃下，可放置保存24-48小時(shí)；-20℃下，可放置保存1個(gè)月；-70℃下，可放置保存6個(gè)月。
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