PCR反應(yīng)的準(zhǔn)備工作及循環(huán)步驟詳解
PCR反應(yīng)開始前，你需要準(zhǔn)備好DNA模板（基因組DNA或者反轉(zhuǎn)錄制備的cDNA）,特異性的引物（手動(dòng)設(shè)計(jì)或利用軟件設(shè)計(jì)）并選擇合適的商業(yè)化DNA聚合酶（根據(jù)實(shí)驗(yàn)的目的不同做出決定）。準(zhǔn)備工作如下：
1. DNA聚合酶的選擇。
市面上有多種DNA聚合酶可供選擇，他們的特性也各有不同。因此你需要選擇最適合自己實(shí)驗(yàn)需要的產(chǎn)品。通常我們將DNA聚合酶分為高保真性聚合酶和普通的Taq聚合酶。如果你希望得到?jīng)]有任何突變的PCR產(chǎn)物，那應(yīng)當(dāng)選擇高保真聚合酶。若你只是希望判斷特異性序列的存在與否，那普通的Taq聚合酶已經(jīng)足夠。另外要注意的一點(diǎn)是，進(jìn)行T載體連接的時(shí)候，要了解高保真的聚合酶所得的產(chǎn)物是沒有A末端的，因此你在T載體連接之前需要進(jìn)行加A反應(yīng)�；蛘咧苯舆x用普通的Taq聚合酶。
2. 引物。
引物特異性會(huì)影響到PCR反應(yīng)成功的可能性，好的引物設(shè)計(jì)對PCR成功至關(guān)重要。設(shè)計(jì)引物時(shí)，有以下幾條原則需要謹(jǐn)慎考慮：
1). 引物長度。通常PCR引物長度在18-22個(gè)堿基之間。這對引物的特異性以及退火溫度而言均已足夠。
2). 解鏈溫度Tm。Tm值的定義是使得一半雙鏈DNA解螺旋成為單鏈DNA的溫度。引物的Tm值通常要在52-58度之間。
3). GC含量。最適合的GC含量為40-60%。
就目前而言很多軟件都可以用來設(shè)計(jì)引物，如primer5和Oligo。通常這些軟件設(shè)計(jì)得到的引物均可以滿足需要。
準(zhǔn)備好各種試劑和PCR儀，就可以開始PCR實(shí)驗(yàn).將各種試劑混合并按照說明書設(shè)置PCR反應(yīng)。一般PCR循環(huán)步驟如下：
1. 起始步驟：
這對于熱啟動(dòng)PCR而言是必須的，將反應(yīng)混合液加熱至94-98度以激活DNA聚合酶。這一步的時(shí)間取決于所選用的DNA聚合酶。
2. 變性步驟：
DNA本身是雙鏈結(jié)構(gòu)，而DNA擴(kuò)增需要引物與單鏈DNA模板相結(jié)合。在這一步，反應(yīng)混合液被加熱至94-98度保持20-30秒以破壞雙鏈間的氫鍵以便釋放出單鏈DNA。這是PCR循環(huán)中的第一步。
3. 退火步驟：
變性之后，DNA模板以單鏈的形式在反應(yīng)混合液中存在。因?yàn)榉磻?yīng)體系中的引物與DNA模板互補(bǔ)，當(dāng)反應(yīng)溫度降至50-65度時(shí)，引物與互補(bǔ)的序列形成氫鍵。退火溫度主要取決于引物的Tm值，通常比引物Tm值低3-5度。這一步通常維持20-40秒，而聚合酶會(huì)結(jié)合至引物-模板雙鏈處開始DNA合成。
4. 延伸步驟：
在這一步，DNA聚合酶開始DNA合成，因此這一步的溫度選取的是DNA聚合酶的最優(yōu)溫度。通常我們選用72度，但某些DNA聚合酶的最適溫度是68度。這一步與體內(nèi)的DNA復(fù)制很相似：DNA聚合酶按照堿基互補(bǔ)規(guī)律將dNTPs加到引物的3’末端最終得到新的DNA雙鏈片段。延伸時(shí)間取決于目的DNA片段的長度和DNA聚合酶的合成能力。一般而言DNA聚合酶每60秒能夠合成1kb長度的DNA。
5. 第2步至第4步稱為一個(gè)循環(huán)：
每次循環(huán)之后DNA的量均是前一次的兩倍。通常一次PCR反應(yīng)進(jìn)行30-35個(gè)循環(huán)。在前幾輪的PCR循環(huán)過程中PCR產(chǎn)物的量以指數(shù)速率增長，但是到了反應(yīng)后期隨著dNTPs和引物的量的減少以及DNA聚合酶的失活，反應(yīng)速率逐漸下降，因此PCR反應(yīng)的產(chǎn)量也受到了限制。
6. 最后的延伸步驟：
當(dāng)30-35個(gè)循環(huán)結(jié)束后，我們通常會(huì)以68-74度延伸5-10分鐘，這是希望使反應(yīng)體系中殘留的單鏈DNA全部反應(yīng)完畢。
7. 維持時(shí)間：
通常我們設(shè)置4-10度為反應(yīng)后PCR產(chǎn)物的保存溫度。
1. DNA聚合酶的選擇。
市面上有多種DNA聚合酶可供選擇，他們的特性也各有不同。因此你需要選擇最適合自己實(shí)驗(yàn)需要的產(chǎn)品。通常我們將DNA聚合酶分為高保真性聚合酶和普通的Taq聚合酶。如果你希望得到?jīng)]有任何突變的PCR產(chǎn)物，那應(yīng)當(dāng)選擇高保真聚合酶。若你只是希望判斷特異性序列的存在與否，那普通的Taq聚合酶已經(jīng)足夠。另外要注意的一點(diǎn)是，進(jìn)行T載體連接的時(shí)候，要了解高保真的聚合酶所得的產(chǎn)物是沒有A末端的，因此你在T載體連接之前需要進(jìn)行加A反應(yīng)�；蛘咧苯舆x用普通的Taq聚合酶。
2. 引物。
引物特異性會(huì)影響到PCR反應(yīng)成功的可能性，好的引物設(shè)計(jì)對PCR成功至關(guān)重要。設(shè)計(jì)引物時(shí)，有以下幾條原則需要謹(jǐn)慎考慮：
1). 引物長度。通常PCR引物長度在18-22個(gè)堿基之間。這對引物的特異性以及退火溫度而言均已足夠。
2). 解鏈溫度Tm。Tm值的定義是使得一半雙鏈DNA解螺旋成為單鏈DNA的溫度。引物的Tm值通常要在52-58度之間。
3). GC含量。最適合的GC含量為40-60%。
就目前而言很多軟件都可以用來設(shè)計(jì)引物，如primer5和Oligo。通常這些軟件設(shè)計(jì)得到的引物均可以滿足需要。
準(zhǔn)備好各種試劑和PCR儀，就可以開始PCR實(shí)驗(yàn).將各種試劑混合并按照說明書設(shè)置PCR反應(yīng)。一般PCR循環(huán)步驟如下：
1. 起始步驟：
這對于熱啟動(dòng)PCR而言是必須的，將反應(yīng)混合液加熱至94-98度以激活DNA聚合酶。這一步的時(shí)間取決于所選用的DNA聚合酶。
2. 變性步驟：
DNA本身是雙鏈結(jié)構(gòu)，而DNA擴(kuò)增需要引物與單鏈DNA模板相結(jié)合。在這一步，反應(yīng)混合液被加熱至94-98度保持20-30秒以破壞雙鏈間的氫鍵以便釋放出單鏈DNA。這是PCR循環(huán)中的第一步。
3. 退火步驟：
變性之后，DNA模板以單鏈的形式在反應(yīng)混合液中存在。因?yàn)榉磻?yīng)體系中的引物與DNA模板互補(bǔ)，當(dāng)反應(yīng)溫度降至50-65度時(shí)，引物與互補(bǔ)的序列形成氫鍵。退火溫度主要取決于引物的Tm值，通常比引物Tm值低3-5度。這一步通常維持20-40秒，而聚合酶會(huì)結(jié)合至引物-模板雙鏈處開始DNA合成。
4. 延伸步驟：
在這一步，DNA聚合酶開始DNA合成，因此這一步的溫度選取的是DNA聚合酶的最優(yōu)溫度。通常我們選用72度，但某些DNA聚合酶的最適溫度是68度。這一步與體內(nèi)的DNA復(fù)制很相似：DNA聚合酶按照堿基互補(bǔ)規(guī)律將dNTPs加到引物的3’末端最終得到新的DNA雙鏈片段。延伸時(shí)間取決于目的DNA片段的長度和DNA聚合酶的合成能力。一般而言DNA聚合酶每60秒能夠合成1kb長度的DNA。
5. 第2步至第4步稱為一個(gè)循環(huán)：
每次循環(huán)之后DNA的量均是前一次的兩倍。通常一次PCR反應(yīng)進(jìn)行30-35個(gè)循環(huán)。在前幾輪的PCR循環(huán)過程中PCR產(chǎn)物的量以指數(shù)速率增長，但是到了反應(yīng)后期隨著dNTPs和引物的量的減少以及DNA聚合酶的失活，反應(yīng)速率逐漸下降，因此PCR反應(yīng)的產(chǎn)量也受到了限制。
6. 最后的延伸步驟：
當(dāng)30-35個(gè)循環(huán)結(jié)束后，我們通常會(huì)以68-74度延伸5-10分鐘，這是希望使反應(yīng)體系中殘留的單鏈DNA全部反應(yīng)完畢。
7. 維持時(shí)間：
通常我們設(shè)置4-10度為反應(yīng)后PCR產(chǎn)物的保存溫度。
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