原位PCR使用原理、分類及應用介紹
原位PCR
1概述
自20世紀80年代中期PCR技術誕生以來, 研究人員就一直探索著將PCR技術與形態(tài)學研究結合起來。1990年, A.T. Haase等首創(chuàng)了原位PCR(In situ PCR, ISPCR), 當時稱為 “細胞內PCR”。原位PCR是原位雜交和PCR結合的產物, 兼有二者的優(yōu)點, 具有較好的靈敏性與專一性, 可同時獲得組織、細胞及染色體的形態(tài)結構信息與分子信息, 又能檢測出細胞中單拷貝或低拷貝的DNA、RNA序列。
2 原位PCR原理
原位PCR是通過在單細胞或組織切片上對特異DNA(或cDNA)進行PCR擴增, 然后采用原位雜交或免疫組織化學反應、熒光檢測等技術進行細胞內特定核酸序列的檢出及定位的分子技術。原位PCR技術的待檢標本一般先經化學固定，以保持組織細胞的良好形態(tài)結構。細胞膜和核膜均具有一定的通透性，當進行PCR擴增時，各種成分，如引物，DNA聚合酶，核苷酸等均可進入細胞內或細胞核內，以固定在細胞內或細胞核內的RNA或DNA為模板，于原位進行擴增。擴增的產物一般分子較大，或互相交織，不易穿過細胞膜或在膜內外彌散，從而被保留在原位。這樣原有的細胞內單拷貝或低拷貝的特定DNA或RNA序列在原位以呈指數(shù)極擴增，擴增的產物就很容易被原位雜交技術檢查。
3 原位PCR類型
3.1 直接原位PCR
直接原位PCR是使用標記的引物或游離核苷酸進行原位PCR反應, 這種標記分子隨后進入擴增產物中, 擴增結果可直接觀察而不需要進行原位雜交(圖1) 。
優(yōu)點：
（1）操作簡便；
（2）流程短；
（3）省時。
自20世紀80年代中期PCR技術誕生以來, 研究人員就一直探索著將PCR技術與形態(tài)學研究結合起來。1990年, A.T. Haase等首創(chuàng)了原位PCR(In situ PCR, ISPCR), 當時稱為 “細胞內PCR”。原位PCR是原位雜交和PCR結合的產物, 兼有二者的優(yōu)點, 具有較好的靈敏性與專一性, 可同時獲得組織、細胞及染色體的形態(tài)結構信息與分子信息, 又能檢測出細胞中單拷貝或低拷貝的DNA、RNA序列。
2 原位PCR原理
原位PCR是通過在單細胞或組織切片上對特異DNA(或cDNA)進行PCR擴增, 然后采用原位雜交或免疫組織化學反應、熒光檢測等技術進行細胞內特定核酸序列的檢出及定位的分子技術。原位PCR技術的待檢標本一般先經化學固定，以保持組織細胞的良好形態(tài)結構。細胞膜和核膜均具有一定的通透性，當進行PCR擴增時，各種成分，如引物，DNA聚合酶，核苷酸等均可進入細胞內或細胞核內，以固定在細胞內或細胞核內的RNA或DNA為模板，于原位進行擴增。擴增的產物一般分子較大，或互相交織，不易穿過細胞膜或在膜內外彌散，從而被保留在原位。這樣原有的細胞內單拷貝或低拷貝的特定DNA或RNA序列在原位以呈指數(shù)極擴增，擴增的產物就很容易被原位雜交技術檢查。
3 原位PCR類型
3.1 直接原位PCR
直接原位PCR是使用標記的引物或游離核苷酸進行原位PCR反應, 這種標記分子隨后進入擴增產物中, 擴增結果可直接觀察而不需要進行原位雜交(圖1) 。
優(yōu)點：
（1）操作簡便；
（2）流程短；
（3）省時。
缺點：
（1）易發(fā)生引物錯配或非特異性退火, 容易出現(xiàn)假陽性;
（2）標記的引物會降低PCR效率。
3.2 間接原位PCR
間接原位PCR是在沒有標記物的情況下進行PCR反應, 擴增反應結束后, 再用原位雜交技術來檢測擴增的信號(圖1)。
優(yōu)點：可以克服由于DNA修復或引物錯配引起的非特異性問題, 成為目前最廣泛使用的方案。
缺點：需要進行擴增反應后的洗脫和原位雜交過程, 所需時間相對較長。
（1）易發(fā)生引物錯配或非特異性退火, 容易出現(xiàn)假陽性;
（2）標記的引物會降低PCR效率。
3.2 間接原位PCR
間接原位PCR是在沒有標記物的情況下進行PCR反應, 擴增反應結束后, 再用原位雜交技術來檢測擴增的信號(圖1)。
優(yōu)點：可以克服由于DNA修復或引物錯配引起的非特異性問題, 成為目前最廣泛使用的方案。
缺點：需要進行擴增反應后的洗脫和原位雜交過程, 所需時間相對較長。
圖1 直接原位PCR和間接原位PCR
3.3 原位反轉錄PCR
在原位 PCR 中加上一步反轉錄過程(RT) , 新形成的cDNA作為模板用于擴增, 這個過程叫做原位反轉錄PCR( in situ reverse transcription PCR, 簡稱原位RTPCR)。它又分為直接原位RTPCR和間接原位RTPCR兩種(圖2)。
原位RT PCR可用來檢測細胞或組織中低拷貝的mRNA或特異基因的表達。
Tips：在原位 RTPCR 中, 首先要對組織樣品進DNA 酶處理, 以破壞組織細胞中的DNA。
圖2 原位反轉錄PCR
3.4 PCR原位再生式序列復制反應
Zebe等1994年率先提出了原位再生式復制反應( Selfsustained sequence replication reaction, 簡稱3SR反應)。它可作為原位RTPCR的一種選擇方法用于完整的細胞和組織切片中低拷貝數(shù)mRNA的檢測。
優(yōu)點：有利于與免疫組織化學相結合。
4 植物原位 PCR 技術的操作步驟
植物原位 PCR 的基本步驟包括標本制備、預處理、原位擴增、后處理和檢測等。
4.1 標本制備
固定劑的選擇和固定的時間、溫度因材料標本不同而各異。但固定條件的確定, 必須同時滿足 2 個條件:
①保持染色體、細胞和組織標本形態(tài)結構的完整性;
②將原位程序中擴增效率的損失減到最小。
Tips：
①對于DNA的原位 PCR, 交聯(lián)型固定劑(福爾馬林、4%多聚甲醛、中性甲醛)較為適宜。交聯(lián)型固定劑較利于蛋白質和核酸互相交聯(lián), 使擴增產物保留在原位,防止其向細胞外擴散或被洗脫。
②固定時的溫度也會對結果產生影響, 室溫或 37℃固定24～48 h, 可獲最強信號。
③標本的年齡對實驗結果影響也很大, 最好采用新鮮制備的不超過1個月的染色體標本。用新鮮固定的細胞做原位 PCR, 要比存檔的石蠟切片做原位 PCR 敏感得多。
4.2 預處理
預處理可增加細胞的通透性, 促使反應試劑進入細胞內, 并使待擴增的靶序列暴露。在進行消化處理時, 酶種類的選擇、濃度、溫度和處理時間等條件的優(yōu)化對于原位PCR都很重要
Tips：
①胃蛋白酶、胰蛋白酶或蛋白酶K均可用于消化。推薦使用胃蛋白酶或胰蛋白酶, 因為蛋白酶K較難失活且易引起過度消化, 而胃蛋白酶、胰蛋白酶在以后的洗滌步驟中, 可通過提高pH抑制其活性, 或通過加熱使其失活。
②酶處理的方法取決于固定劑和標本類型。多聚甲醛和戊-二-醛固定的材料比FAA固定的材料需更長的酶處理時間, 且具小液泡的組織比具大液泡的組織預處理時間更長。
③組織切片的細胞仍具有細胞壁, 應進行適宜的預處理。
④對于解離好的染色體標本可不必進行蛋白酶消化, 而對于解離不充分的染色體標本要特別注意消化過度或消化不足。消化過度則擴增的靶序列易丟失, 消化不足則不利反應液的進入, 二者均會導致假陰性的出現(xiàn)。
⑤有時候, 蛋白酶消化之前還需進行一些其他處理, 如進行蛋白酶消化之前, 進行了果膠酶處理。果膠酶處理可去除非特異性物質的污染。
4.3 原位擴增
原位PCR擴增體系中, 各組分的濃度和反應溫度、時間、循環(huán)次數(shù)等的優(yōu)化極為重要。由于玻片和細胞蛋白可能對反應液有所吸附, 因此, 與液相PCR相比, 原位PCR擴增溶液中各組分濃度相對較高。
Tips：
①液相PCR中最優(yōu)的MgCl2濃度為1.5 mmol/L, 而原位PCR中為4.5 mmol/L;
②液相PCR中Taq DNA聚合酶的常規(guī)使用量為1.5 U, 而原位PCR要5 U才能產生較強的信號；
③反應溫度因引物而定；
④循環(huán)次數(shù)不宜過高, 一般為20～30。
⑤為了提高特異性, 可采用多步循環(huán)法或半套式擴增。
⑥為了確定原位 PCR 檢測的準確性, 必須設置陰性對照, 可設置為擴增反應液中不加入 Taq DNA聚合酶或引物。
⑦間接法原位PCR反應液中的組分與普通PCR一樣, 而直接原位PCR反應液中則包含了標記的引物或單核苷酸。在目前植物原位PCR的成功報道中, 都采用DIG-11-dUTP單核苷酸標記, 但dTTP與DIG-11-dUTP的使用濃度、二者的比例
各不相同。dTTP 和DIG-11-dUTP的終濃度比是原位擴增順利進行的一個要素, 比值太高會使得DIG-11-dUTP在擴增過程中失去競爭力, 比值太低可能使信號擴散, DIG-11-dUTP 的濃度太高會形成空間阻礙。因此, 要優(yōu)化出最適宜的濃度和比例。
⑧反應液的體積應根據(jù)標本在玻片上的多少進行調整, 挑選合適大小的原位克隆環(huán)EasiSeal, 以防止反應液溢出或覆蓋不足。
⑨應根據(jù)不同植物材料、不同標本類型等各種因素, 優(yōu)化出適宜的原位PCR體系,才能獲得理想的結果。
4.4 后處理
大部分標本在原位擴增后要進行洗滌, 以降低背景和保留強陽性信號。針對不同的標本及其檢測方法, 其后處理也有所不同。
Tips：
①為提高檢測靈敏性和特異性, 使擴增產物保留在細胞內, 在洗滌完后, 用4%多聚甲醛或2%戊-二-醛對材料進行后固定, 可獲得較好的效果。
②對于染色體標本, 特別是纖維素酶和果膠酶處理較好的染色體標本, 其不似組織或細胞標本有細胞壁的保護, 擴增后的洗滌必須降低強度, 否則很容易使擴增信號丟失。
③洗滌強度應根據(jù)檢測信號進行優(yōu)化, 若信號擴散可增加洗滌強度, 若出現(xiàn)假陰性, 則要降低洗滌強度。
4.5 檢測
目前, 使用非放射性標記和檢測DNA探針有生物素標記、地-高-辛標記和熒光素標記3 大檢測系統(tǒng)。
Tips：
①采用地-高-辛標記檢測系統(tǒng), 用 NBT/BCIP(硝基四唑藍/5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸鹽)顯色進行檢測。
②采用 Anti-DIG-Fluorescein(熒光綠－地-高-辛抗體)進行免疫反應, 在顯色反應中可選擇DAPI (4,6-二脒基-2-苯基吲哚)或PI (碘化丙啶), 或DAPI/PI, 選擇合適的熒光激發(fā)塊進行檢測。
③原位PCR的檢測系統(tǒng)可參考原位雜交的檢測方法進行。
5 原位PCR的應用
5.1 在醫(yī)學上的應用
（1）疾病中外源性基因檢測；
（2）診斷和某些相應基因的定位, 如HIV、HBV、EB 等病毒的檢測。
5.2 在動物上的應用
主要用于流行病毒的檢測。
5.3 在植物上的應用
（1）細胞或組織水平上的基因檢測和定位；
（2）染色體水平上的基因檢測和定位；
（3）單拷貝、低拷貝和多拷貝基因或特異序列的檢測；
①檢測植物材料是否受到外源致病基因的侵染和侵染部位;
②檢測內源基因或特異序列在植物細胞或組織中的表達及分布;
③確定內源基因、特異序列及各種抗性基因在染色體上的位置；
④結合染色體帶型分析, 構建物理圖譜。
（4）雜種中親本染色體的鑒定；
（5）物種進化的研究；
（6）遺傳轉化材料的分析。
雖然目前原位 PCR 技術在植物上的應用存在一定的困難, 但隨著技術的成熟, 其應用前景必將廣闊。只要在某種作物上建立了原位PCR體系, 則可為該類作物功能基因的研究奠定基礎，在該類作物上的相關研究將會有更大的發(fā)展空間。
