隨著2015年精準醫(yī)療計劃的提出，液體活檢技術備受關注。液體活檢常見的三種有效素材主要有：游離DNA（circulating cell-free DNA，cfDNA）、循環(huán)腫瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）和外泌體。

圖1 液體活檢方案。人體血液中含有細胞、胞外膜囊泡（EMVS）、游離DNA（cfDNA）、游離RNA（cfRNA）和蛋白質(zhì)，可作為各種疾病的生物標志物

 

一、什么是游離DNA?
 

游離DNA又稱循環(huán)DNA、無細胞DNA，是指存在于血漿、血清或尿液等體液中的細胞外DNA。循環(huán)腫瘤DNA是指壞死或凋亡的腫瘤細胞釋放到外周血中的腫瘤DNA片段，是腫瘤患者cfDNA的一種。最早在1948年，Mandel次在人類血液中檢測到存在cfDNA，但當時并沒有引起科學界的關注。直到1977年，Leon等報道了腫瘤患者外周血中存在較高水平的cfDNA，隨后眾多學者開始了腫瘤患者外周血中cfDNA研究。1997年，香港的盧煜明教授運用PCR技術，在孕婦的血漿中擴增了Y染色體特異性片段，證明懷有男胎的孕婦血漿中存在胎兒cfDNA，從而為無創(chuàng)產(chǎn)前篩查奠定了基礎。
 

關于cfDNA的產(chǎn)生來源，目前普遍認為細胞主動釋放、細胞發(fā)生凋亡、細胞壞死釋放的DNA片段是cfDNA的主要來源。一般來說，癌癥患者的正常循環(huán)cfDNA水平比健康人高得多。因為隨著腫瘤體積的增大，細胞的更新也隨之增加，凋亡和壞死細胞的數(shù)量也隨之增加。在正常的生理情況下，凋亡和壞死的殘留物可通過浸潤的吞噬細胞清除。但這不能有效地發(fā)生在腫瘤腫塊內(nèi)，導致細胞碎片的積累不可避免地釋放到循環(huán)中使cfDNA濃度顯著升高。

圖2 游離DNA的主要來源

 

cfDNA大部分為雙鏈DNA分子，其片段分布與核小體的結(jié)構(gòu)有關，每個核小體單位包括一個組蛋白八聚體、DNA分子及一分子H1；組蛋白八聚體構(gòu)成核小體的盤狀核心結(jié)構(gòu)，146bp的DNA分子超螺旋盤繞組蛋白八聚體1.75圈，組蛋白H1在核心顆粒外結(jié)合額外20bp DNA，鎖住核小體DNA的進出端，起到穩(wěn)定核小體的作用。因此cfDNA長度主要集中在80-300bp，峰值位于166bp左右，且存在10.4bp的波動。cfDNA在健康個體中通常濃度很低，血漿cfDNA被認為主要來自造血系正常細胞的凋亡，其他組織的貢獻很小。并且cfDNA的半衰期很短，僅1-2小時，不穩(wěn)定易降解。

相比于組織而言，檢測cfDNA具有三大優(yōu)勢：

✦ 可及性：cfDNA容易獲取，且可以反復取樣；
✦ 全面性：可全面反映腫瘤組織的異質(zhì)性；
✦ 實時性：可實時動態(tài)監(jiān)測疾病的狀態(tài)（如耐藥方面），因此cfDNA檢測逐漸成為體外診斷應用方面的寵兒。

圖3 cfDNA的結(jié)構(gòu)

圖4 常規(guī)測序文庫制備測定cfDNA的片段長度

 

二、游離DNA應用實例

圖5 cfDNA的應用

 

1、無創(chuàng)產(chǎn)前篩查（NIPT）
 

基于1997年盧煜明教授及其團隊發(fā)現(xiàn)孕婦的血漿內(nèi)存有高濃度的胎兒DNA，他們研發(fā)推出了唐氏綜合征的無創(chuàng)檢驗方法—NIPT（noninvasive prenatal testing），迅速被超過90個國家所采用。NIPT即無創(chuàng)性胎兒染色體非整倍體檢測，也稱無創(chuàng)產(chǎn)前DNA檢測，在臨床上主要用于唐氏綜合征的篩查。通過采集孕媽媽外周血，從中提取游離DNA（包含媽媽和寶寶DNA），來分析寶寶的染色體情況。但以目前的醫(yī)療水平還不能治愈唐氏綜合征，所以加強孕期產(chǎn)檢，減少唐氏綜合征患兒的出生十分重要。

圖6 NIPT檢驗流程

 

2、腫瘤相關分析
 

無需有創(chuàng)腫瘤活檢，而是直接從常規(guī)抽血中分析來自腫瘤的DNA，cfDNA分析在癌癥發(fā)展、診斷和治療的整個自然過程中具有多種潛在應用。Web of science引文報告顯示：2017年與2018年間與cfDNA研究有關的文章，51%聚焦于腫瘤方面，由此可見cfDNA在腫瘤方向的應用火熱。2016年6月1日，F(xiàn)DA批準首個適用于血液cfDNA檢測的，用于檢測非小細胞肺癌（NSCLC）患者表皮生長因子受體（EGFR）基因突變的基因檢測試劑盒，這是作為cfDNA首次應用于腫瘤伴隨診斷、藥物療效監(jiān)測的批準。同時Nitzan等于nature reviews cancer雜志上發(fā)表名為“Liquid biopsies come of age: towards implementation of circulating tumour DNA”的文章表明ctDNA可用于耐藥突變及新發(fā)突變分析。

圖7 ctDNA可用于耐藥突變及新發(fā)突變分析應用

 

2020年發(fā)表于Nature雜志上的一篇文章，研究者對早期的肺癌患者治療前血漿中ctDNA的含量進行檢測研究，發(fā)現(xiàn)在一定時間內(nèi)（監(jiān)測100個月）肺癌患者治療前ctDNA高的病人復發(fā)率以及遠處轉(zhuǎn)移率均高于ctDNA含量低的病人，因此ctDNA對于腫瘤的監(jiān)測及預后方面具有一定積極意義。

圖8 cfDNA在腫瘤動態(tài)監(jiān)測及預后方面的應用

 

Jay Shendure等于Cell雜志上發(fā)表的文章利用癌癥患者的ctDNA樣本進行測序，發(fā)現(xiàn)不同的癌癥類型可以ctDNA上產(chǎn)生不同的核小體的指紋。因此對于某些癌癥患者而言，研究者可以利用ctDNA鑒別腫瘤的組織學來源。

圖9 ctDNA可以用于分析腫瘤組織來源（在癌癥溯源方面應用）

 

由復旦大學金力院士牽頭的癌癥早篩研究結(jié)果于2020年發(fā)表于Nature Communication雜志，該研究采用PanSeer癌癥早篩技術，通過檢測cfDNA甲基化狀態(tài)實現(xiàn)多癌種篩查，可提前4年發(fā)現(xiàn)癌癥患者血液中的甲基化信號，實現(xiàn)癌癥早篩的功能。

圖10 cfDNA在癌癥早篩中的應用

 

3、微生物感染診斷
 

與傳統(tǒng)微生物檢測相比，微生物游離DNA（mcfDNA）檢測陽性率更高，mcfDNA目前已在臨床感染的診治中發(fā)揮了重要作用，如膿毒癥、社區(qū)獲得性肺炎、結(jié)核病、侵襲性真菌病、尿路感染、器官移植后感染等。

Blauwkamp等人于Nature Microbiology上發(fā)表的血漿mcfDNA高通量測序研究中表明：臨床納入348例疑似膿毒癥患者，與首次陽性的血培養(yǎng)相比，其陽性符合率為93.7%。在出現(xiàn)癥狀前出現(xiàn)抗菌藥物的患者中，NGS檢出可靠或者確定的病原比例為47.9%，血培養(yǎng)靈敏度為19.6%，由此可見mcf檢測微生物感染的優(yōu)勢。

 

圖11 微生物游離DNA在感染診斷中的應用