由于共洗脫雜質(zhì)的存在，對(duì)固相多肽合成法（SPPS）合成的親水性肽——組蛋白H3（1-20）的純化是一個(gè)艱巨的挑戰(zhàn)。在這個(gè)分享案例中，我們展示了如何通過(guò)使用PurePep EasyClean （PEC）多肽純化試劑盒和反向高效液相色譜法（RP-HPLC）進(jìn)行正交肽純化來(lái)提高肽的純度和降低純化過(guò)程中的溶劑消耗。

引言
肽相關(guān)的一些雜質(zhì)存在，會(huì)顯著影響藥物研發(fā)的結(jié)果（例如假陽(yáng)性結(jié)果），為保證臨床級(jí)肽的高質(zhì)量性和結(jié)果測(cè)定的高可靠性，有必要將這些雜質(zhì)從活性藥物成分中去除。

化學(xué)合成肽的純化主要是通過(guò)傳統(tǒng)的色譜方法進(jìn)行，RP-HPLC是最常用的方法。此外，快速色譜法（flash）也是研究級(jí)肽純化的通用方法。然而，這兩種色譜技術(shù)可能會(huì)都會(huì)忽略共洗脫雜質(zhì)的存在。

相比之下，Gyros Protein Technologies公司的正交純化PurePep EasyClean（PEC）技術(shù)與傳統(tǒng)色譜法不同，它基于化學(xué)選擇性分離原理。首先在固相多肽合成（SPPS）過(guò)程最后添加無(wú)痕可裂解連接子（PEC-Linker）對(duì)全長(zhǎng)目標(biāo)肽進(jìn)行修飾，而SPPS過(guò)程中的封端（Capping）確保了只有全長(zhǎng)目標(biāo)肽可以添加上PEC-linker，然后通過(guò)正交捕獲和釋放技術(shù)（catch-and-release）直接將目標(biāo)肽從復(fù)雜的混合物中分離出來(lái)。

在這個(gè)案例中，我們通過(guò)使用PEC多肽純化試劑盒（基礎(chǔ)裝）純化組蛋白H3（1-20）肽的極性片段，并且驗(yàn)證了PEC和RP-HPLC的正交性。

討論
PEC級(jí)肽
從圖1（左）的色譜圖來(lái)看，粗組蛋白H3（1-20）看起來(lái)似乎很純凈，但是一些缺失序列相應(yīng)的峰卻在質(zhì)譜圖中集中大量出現(xiàn)。其中主要的雜質(zhì)是丙氨酸（Ala）、精氨酸（Arg）和蘇氨酸（Thr）缺失的序列。用0.1％HFBA進(jìn)行HPLC分析顯示出了潛在的峰，并且測(cè)定了粗品的純度為29％。
 

圖1（右）顯示了PEC純化肽的色譜圖。仔細(xì)觀察比較質(zhì)譜圖（右側(cè)圖1中的插圖）發(fā)現(xiàn)PEC單次純化有效地去除了共洗脫雜質(zhì)，從而確保了分析結(jié)果的高可靠性。

由于七氟丁酸酐（HFBA）能夠?qū)⒛繕?biāo)肽從截短的序列中分離出來(lái)，因此利用HFBA增強(qiáng)的反向快速色譜法（flash）進(jìn)行首次純化并與PEC純化進(jìn)行比較。采用該方法后，粗品純度只提高到了66％（表2）。而使用PEC多肽純化試劑盒純化之后，純度達(dá)到了86％。

利用PEC獲得臨床級(jí)肽
接下來(lái)，我們利用RP-HPLC進(jìn)行對(duì)上述兩種方式純化的肽進(jìn)行二次純化，以獲得臨床級(jí)肽。純度分別從29％（粗品）提高到了85％和96％（表2）。由此可見(jiàn)，PEC在與RP-HPLC的正交組合純化肽中表現(xiàn)出了非常優(yōu)異的純化效率。


節(jié)省溶劑消耗

色譜分離會(huì)消耗大量的有機(jī)溶劑，減少溶劑的使用是改善肽純化生態(tài)足跡的關(guān)鍵點(diǎn)。

ACN的消耗量是評(píng)估正交法生態(tài)效益的合理指標(biāo)。由于PEC的捕捉和釋放（catch-and-release）原理，純化肽只需要使用少量的有機(jī)溶劑，并且產(chǎn)生的廢物更少。在整個(gè)肽純化過(guò)程中，僅積累了50 ml 的ACN和200 ml 的總廢料。

而快速色譜法（flash）純化則需要500 ml 的ACN，并且產(chǎn)生總計(jì)1500 ml 廢料。相比之下，PEC純化從整體上節(jié)省了85％以上的溶劑使用并大量減少?gòu)U料生成。

當(dāng)考慮結(jié)合RP-HPLC進(jìn)行二次純化時(shí)，額外需要添加1000 ml 的ACN并且總廢料生成增加了3000 ml。

總體來(lái)看，正交PEC純化與RP-HPLC法結(jié)合，可以節(jié)省約30％的昂貴溶劑消耗并且大大減少有害廢料的產(chǎn)生。

結(jié)果
1 PEC純化可以在單個(gè)正交純化步驟中可以有效去除共洗脫截?cái)嘈蛄?/span>

2 正交PEC和RP-HPLC結(jié)合獲得了具有挑戰(zhàn)性的超高純度的肽
3 通過(guò)正交PEC純化，可節(jié)省高達(dá)85％的溶劑使用并大量減少總廢料生成