鈣藍(lán)素AM實(shí)驗(yàn)方案及操作步驟
鈣藍(lán)素AM實(shí)驗(yàn)方案
操作步驟
（1）準(zhǔn)備HHBS緩沖液，10％Pluronic®F-127溶液和25 mM Probenecid溶液。
（2）在高質(zhì)量無水DMSO中制備2 mM至5 mM Calcein Blue，AM * CAS 168482-84-6 *儲(chǔ)備液。
（2.1）卡介素藍(lán)量，AM * CAS 168482-84-6 *使用量：1毫克
（2.2）所需濃度：2 mM
（2.3）在合適的容器中，將1mg鈣黃綠素，AM * CAS 168482-84-6 *與1074.32μL無水DMSO混合。
（3）用含有10μM鈣黃綠素的HHBS制備2X工作溶液，AM * CAS 168482-84-6 * 4，0.08％Pluronic®F-127和2 mM丙磺舒。
（3.1）Calcein Blue的終孔內(nèi)濃度，AM * CAS 168482-84-6 *：5μM
（3.2）Pluronic®F-127的終孔內(nèi)濃度：0.04％
（3.3）終孔內(nèi)濃度的丙磺舒：1mM
（3.4）在合適的容器中混合16μL鈣黃綠素，AM * CAS 168482-84-6 *，25.6μL10％Pluronic®F-127和256μL25mM Probenecid。然后，添加HHBS或您選擇的緩沖液，直到體積為3.2 mL。
注意：對(duì)于大多數(shù)細(xì)胞系，我們建議終濃度為Calcein Blue，AM * CAS 168482-84-6 *為4至5μM。
注意：推薦的Pluronic F-127井濃度終為0.02％至0.04％。
注意：推薦的終濃度為1至2.5 mM的Probenecid。
（4）將100μL染料工作溶液加入已經(jīng)含有100μL培養(yǎng)基的所需孔中。
（4.1）此步驟將染料工作溶液從2X稀釋至1X，并將每種組分的終濃度調(diào)整為以下：5μM鈣黃綠素，AM * CAS 168482-84-6 *，0.04％Pluronic®F-127,1 mM丙磺舒。
（5）孵育染料
（5.1）將染料加載板在細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育20-60分鐘。
（5.2）將染料加載板在室溫下孵育30分鐘。
（6）用1.0 mM Probenecid準(zhǔn)備HHBS緩沖液（或您選擇的緩沖液）。
在合適的容器中加入160μL的25mM丙磺舒。 接下來，添加HHBS或您選擇的緩沖液，直到體積為4 mL。
（7）用HHBS緩沖液或您選擇的緩沖液替換染料工作溶液，使用1.0 mM Probenecid。
（7.1）首先，從所需孔中除去200μL染料工作溶液和培養(yǎng)基。
（7.2）在相同的孔中加入200μL含有1.0mM丙磺舒的HHBS（或您選擇的緩沖液）。
（8）運(yùn)行實(shí)驗(yàn)
（8.1）為您的樣品添加所需的處理。
（8.2）以Ex / Em = 360/445 nm運(yùn)行實(shí)驗(yàn)。
鈣藍(lán)素,AM是美國AAT Bioquest生產(chǎn)的細(xì)胞滲透性鈣黃綠素，它是鈣黃綠素的細(xì)胞滲透型。進(jìn)入活細(xì)胞后，弱熒光鈣黃綠素AM被水解成鈣黃綠素，其激發(fā)/發(fā)射大值與DAPI，Hoechst和AMCA相似。與典型的綠色和紅色熒光團(tuán)（如FITC，TMR和德克薩斯紅）的這種特殊光譜分離為多路復(fù)用實(shí)驗(yàn)提供了額外的選擇。因?yàn)殁}黃綠素AM本身是熒光的，所以可能需要適當(dāng)?shù)倪^濾器組和額外的洗滌步驟以使背景熒光小化。我們的鈣測(cè)定緩沖液可用于有效洗滌細(xì)胞外鈣黃綠素。
百螢 鈣藍(lán)素AM 參數(shù)：
E x(nm) 354
E m(nm) 441
分 子 量 465.41
溶 劑 DMSO
存儲(chǔ)條件 在零下15度以下保存，避免光照
C A S 168482-84-6
鈣藍(lán)素AM適用儀器
流式細(xì)胞儀
Ex: 350nm or 405nm
Em: 450/40 nm
通道: Pacific Blue通道
熒光顯微鏡
Ex: DAPI濾波片組
Em: DAPI濾波片組
推薦孔板: 黑色透明底板
熒光酶標(biāo)儀
Ex: 360nm
Em: 450 nm
Cutoff: 420nm
推薦孔板: 黑色透明底板
讀取模式: 底讀模式
操作步驟
（1）準(zhǔn)備HHBS緩沖液，10％Pluronic®F-127溶液和25 mM Probenecid溶液。
（2）在高質(zhì)量無水DMSO中制備2 mM至5 mM Calcein Blue，AM * CAS 168482-84-6 *儲(chǔ)備液。
（2.1）卡介素藍(lán)量，AM * CAS 168482-84-6 *使用量：1毫克
（2.2）所需濃度：2 mM
（2.3）在合適的容器中，將1mg鈣黃綠素，AM * CAS 168482-84-6 *與1074.32μL無水DMSO混合。
（3）用含有10μM鈣黃綠素的HHBS制備2X工作溶液，AM * CAS 168482-84-6 * 4，0.08％Pluronic®F-127和2 mM丙磺舒。
（3.1）Calcein Blue的終孔內(nèi)濃度，AM * CAS 168482-84-6 *：5μM
（3.2）Pluronic®F-127的終孔內(nèi)濃度：0.04％
（3.3）終孔內(nèi)濃度的丙磺舒：1mM
（3.4）在合適的容器中混合16μL鈣黃綠素，AM * CAS 168482-84-6 *，25.6μL10％Pluronic®F-127和256μL25mM Probenecid。然后，添加HHBS或您選擇的緩沖液，直到體積為3.2 mL。
注意：對(duì)于大多數(shù)細(xì)胞系，我們建議終濃度為Calcein Blue，AM * CAS 168482-84-6 *為4至5μM。
注意：推薦的Pluronic F-127井濃度終為0.02％至0.04％。
注意：推薦的終濃度為1至2.5 mM的Probenecid。
（4）將100μL染料工作溶液加入已經(jīng)含有100μL培養(yǎng)基的所需孔中。
（4.1）此步驟將染料工作溶液從2X稀釋至1X，并將每種組分的終濃度調(diào)整為以下：5μM鈣黃綠素，AM * CAS 168482-84-6 *，0.04％Pluronic®F-127,1 mM丙磺舒。
（5）孵育染料
（5.1）將染料加載板在細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育20-60分鐘。
（5.2）將染料加載板在室溫下孵育30分鐘。
（6）用1.0 mM Probenecid準(zhǔn)備HHBS緩沖液（或您選擇的緩沖液）。
在合適的容器中加入160μL的25mM丙磺舒。 接下來，添加HHBS或您選擇的緩沖液，直到體積為4 mL。
（7）用HHBS緩沖液或您選擇的緩沖液替換染料工作溶液，使用1.0 mM Probenecid。
（7.1）首先，從所需孔中除去200μL染料工作溶液和培養(yǎng)基。
（7.2）在相同的孔中加入200μL含有1.0mM丙磺舒的HHBS（或您選擇的緩沖液）。
（8）運(yùn)行實(shí)驗(yàn)
（8.1）為您的樣品添加所需的處理。
（8.2）以Ex / Em = 360/445 nm運(yùn)行實(shí)驗(yàn)。
鈣藍(lán)素,AM是美國AAT Bioquest生產(chǎn)的細(xì)胞滲透性鈣黃綠素，它是鈣黃綠素的細(xì)胞滲透型。進(jìn)入活細(xì)胞后，弱熒光鈣黃綠素AM被水解成鈣黃綠素，其激發(fā)/發(fā)射大值與DAPI，Hoechst和AMCA相似。與典型的綠色和紅色熒光團(tuán)（如FITC，TMR和德克薩斯紅）的這種特殊光譜分離為多路復(fù)用實(shí)驗(yàn)提供了額外的選擇。因?yàn)殁}黃綠素AM本身是熒光的，所以可能需要適當(dāng)?shù)倪^濾器組和額外的洗滌步驟以使背景熒光小化。我們的鈣測(cè)定緩沖液可用于有效洗滌細(xì)胞外鈣黃綠素。
百螢 鈣藍(lán)素AM 參數(shù)：
E x(nm) 354
E m(nm) 441
分 子 量 465.41
溶 劑 DMSO
存儲(chǔ)條件 在零下15度以下保存，避免光照
C A S 168482-84-6
鈣藍(lán)素AM適用儀器
流式細(xì)胞儀
Ex: 350nm or 405nm
Em: 450/40 nm
通道: Pacific Blue通道
熒光顯微鏡
Ex: DAPI濾波片組
Em: DAPI濾波片組
推薦孔板: 黑色透明底板
熒光酶標(biāo)儀
Ex: 360nm
Em: 450 nm
Cutoff: 420nm
推薦孔板: 黑色透明底板
讀取模式: 底讀模式
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