ELISA試驗各條件的把控方法和注意事項
1．固相載體的選擇
載體的種類很多，其中包括纖維素、交聯(lián)右旋糖酐、葡萄球菌聚苯乙烯、聚丙烯酰胺等。從使用形式上可有凹孔平板、試管、珠粒等。
聚苯乙烯凹孔板是應用最廣泛的一種載體。聚苯乙烯塑料微量滴定板吸附蛋白的性能好，操作簡便、用量小，適于大批檢查。
由于聚苯乙烯的工藝過程不夠穩(wěn)定,造成各批次差異較大。所以進行ELISA之前，必須進行篩選。檢查方法：
⑴ 吸附性能的檢查：先加抗體包被，然后加入同一稀釋度的酶標抗體，最后加底物、顯色、測OD值,求出總平均OD值,再求出每相鄰兩孔的OD平均值,此均值在總均值的±10%以內(nèi)為合格,若中間孔與四周孔OD值相差太大，或一側(cè)與另一側(cè)孔OD值相差較大均屬不合格。
⑵ 對比測定陽性血清與陰性血清，觀察是否存在明顯差異，若二者OD值相差于10倍以上者為合格。
板的處理。新板一般不用處理,用蒸餾水沖洗即可應用。板用一次即廢。但不少實驗工作者認為用超聲波處理，清潔液Tritonx100、20%乙二醇處理仍可應用。但發(fā)現(xiàn)空白對照顯色較深和陽性樣品顯色結(jié)果不理想時，應棄去不用。
2．載體的吸附條件
載體的吸附均為物理吸附。吸附的多少取決于PH值、溫度、蛋白濃度、離子強度以及吸附時間等。
較好的吸附條件是：離子強度為0.05Mol/L～0.10Mol/L，pH9.0～pH9.6碳酸鹽緩沖液，蛋白濃度為1µg/ml~100µg/ml，4℃過夜或37℃3h。
3．酶標抗體使用濃度的確定
于聚苯乙烯板孔中加足夠量的抗體包被,溫育一定時間，沖洗、把酶標結(jié)合物倍比稀釋，每個稀釋度加2孔,溫育、沖洗、再加底物顯色、比色。以OD值為縱坐標,酶標結(jié)合物的稀釋度為橫坐標，制作曲線。找出OD值為1時，相對應的酶標抗體稀釋度為最適酶標抗體稀釋度。
這個稀釋度是指在這種條件下的最適稀釋度，換個條件就不是最適的了。如1﹕400的酶標抗體稀釋度溫育6h可與1︰6 400稀釋度溫育24h結(jié)果相同。所以一旦條件確定之后，就不要變更，以保證結(jié)果的重復性和相對的準確性。
此最適酶標抗體稀釋度可做為工作濃度，也可提高半個至一個滴度，但不能提高過高，否則非特異性顯色增加。
酶標抗體的滴度反映酶標抗體的質(zhì)量，也可以此比較酶標結(jié)合物的優(yōu)劣。有材料報道認為1︰320滴度為合格,1︰1 000以上更好。酶標抗體滴度越高，用于工作濃度的稀釋倍數(shù)就越大，敏感性就越高，非特異性反應就越低。
4．抗原：
⑴ 抗原的要求：
用于ELISA的抗原必須采用相當純的抗原，如果含有其它雜質(zhì)，將與抗原共同競爭固相載體上的有限位置。用于其它血清學反應的抗原不一定能適用ELISA實驗，必須經(jīng)過試驗，抗原必須能牢固地吸附于載體上，而不喪失其免疫活性，且可得到有規(guī)律的重復的結(jié)果。另外在吸附載體后，對加入的各種試劑產(chǎn)生最小的非特異性吸附，即與陰、陽性血清結(jié)合差異較大。
⑵ 抗原效價的測定
可采用單方陣或雙方陣試驗。①單方陣試驗：以不同稀釋度的抗原包被酶標板，以常規(guī)的1﹕200倍稀釋的陽性血清加入，再加入酶標抗體、顯色、測OD值，以OD值為1.0時，相應的抗原濃度作為使用效價；②雙方陣試驗比較精確，它既能測出抗原的最適濃度又能測出抗體的最適濃度。即將抗原抗體均稀釋成不同濃度進行酶標抗體反應，以血清稀釋倍數(shù)最高的陰、陽性血清的光吸收值差最大的所對應的抗原稀釋度為抗原的使用效價。
已吸附的抗原的固相載體經(jīng)凍干或干燥保存很穩(wěn)定,數(shù)月仍不失活。
5．清洗液
一般采用0.01Mol/L pH 7.2 PBS吐溫緩沖液。吐溫是聚氧乙烯去水山梨醇脂肪酸酯，為非離子型的表面張力物質(zhì),常做助溶劑。吐溫的編號依聚合山梨醇所結(jié)合的脂肪酸種類不同而定。吐溫20是結(jié)合月桂酸、吐溫40是結(jié)合棕櫚酸、吐溫60是結(jié)合硬脂酸,吐溫80是結(jié)合油酸等。通常用吐溫20加入緩沖液內(nèi)做為濕潤劑,以減少非特異性吸附。也可在PBS緩沖液中加入1%牛血清白蛋白(或10%小牛血清或卵清蛋白),特別在抗原包被以后,以牛血清白蛋白緩沖液再包被一次,而占據(jù)孔內(nèi)剩下位置,這樣來減少非特異性反應。
6．反應時間
抗原與抗體、抗體與酶標抗體反應一般在37℃ 2h～3h達到高峰。時間太短,敏感性下降,時間太長,吸附的抗原或復合物(在這個溫度下)可能脫落。
7．抗體
抗體效價的測定同抗原,采用雙方陣試驗。
酶底物反應時間的確定：一般采用15min～30min～45min。也可以標準陽性血清為準,隨時測定其OD值,當達到規(guī)定的OD值時,即終止反應。
載體的種類很多，其中包括纖維素、交聯(lián)右旋糖酐、葡萄球菌聚苯乙烯、聚丙烯酰胺等。從使用形式上可有凹孔平板、試管、珠粒等。
聚苯乙烯凹孔板是應用最廣泛的一種載體。聚苯乙烯塑料微量滴定板吸附蛋白的性能好，操作簡便、用量小，適于大批檢查。
由于聚苯乙烯的工藝過程不夠穩(wěn)定,造成各批次差異較大。所以進行ELISA之前，必須進行篩選。檢查方法：
⑴ 吸附性能的檢查：先加抗體包被，然后加入同一稀釋度的酶標抗體，最后加底物、顯色、測OD值,求出總平均OD值,再求出每相鄰兩孔的OD平均值,此均值在總均值的±10%以內(nèi)為合格,若中間孔與四周孔OD值相差太大，或一側(cè)與另一側(cè)孔OD值相差較大均屬不合格。
⑵ 對比測定陽性血清與陰性血清，觀察是否存在明顯差異，若二者OD值相差于10倍以上者為合格。
板的處理。新板一般不用處理,用蒸餾水沖洗即可應用。板用一次即廢。但不少實驗工作者認為用超聲波處理，清潔液Tritonx100、20%乙二醇處理仍可應用。但發(fā)現(xiàn)空白對照顯色較深和陽性樣品顯色結(jié)果不理想時，應棄去不用。
2．載體的吸附條件
載體的吸附均為物理吸附。吸附的多少取決于PH值、溫度、蛋白濃度、離子強度以及吸附時間等。
較好的吸附條件是：離子強度為0.05Mol/L～0.10Mol/L，pH9.0～pH9.6碳酸鹽緩沖液，蛋白濃度為1µg/ml~100µg/ml，4℃過夜或37℃3h。
3．酶標抗體使用濃度的確定
于聚苯乙烯板孔中加足夠量的抗體包被,溫育一定時間，沖洗、把酶標結(jié)合物倍比稀釋，每個稀釋度加2孔,溫育、沖洗、再加底物顯色、比色。以OD值為縱坐標,酶標結(jié)合物的稀釋度為橫坐標，制作曲線。找出OD值為1時，相對應的酶標抗體稀釋度為最適酶標抗體稀釋度。
這個稀釋度是指在這種條件下的最適稀釋度，換個條件就不是最適的了。如1﹕400的酶標抗體稀釋度溫育6h可與1︰6 400稀釋度溫育24h結(jié)果相同。所以一旦條件確定之后，就不要變更，以保證結(jié)果的重復性和相對的準確性。
此最適酶標抗體稀釋度可做為工作濃度，也可提高半個至一個滴度，但不能提高過高，否則非特異性顯色增加。
酶標抗體的滴度反映酶標抗體的質(zhì)量，也可以此比較酶標結(jié)合物的優(yōu)劣。有材料報道認為1︰320滴度為合格,1︰1 000以上更好。酶標抗體滴度越高，用于工作濃度的稀釋倍數(shù)就越大，敏感性就越高，非特異性反應就越低。
4．抗原：
⑴ 抗原的要求：
用于ELISA的抗原必須采用相當純的抗原，如果含有其它雜質(zhì)，將與抗原共同競爭固相載體上的有限位置。用于其它血清學反應的抗原不一定能適用ELISA實驗，必須經(jīng)過試驗，抗原必須能牢固地吸附于載體上，而不喪失其免疫活性，且可得到有規(guī)律的重復的結(jié)果。另外在吸附載體后，對加入的各種試劑產(chǎn)生最小的非特異性吸附，即與陰、陽性血清結(jié)合差異較大。
⑵ 抗原效價的測定
可采用單方陣或雙方陣試驗。①單方陣試驗：以不同稀釋度的抗原包被酶標板，以常規(guī)的1﹕200倍稀釋的陽性血清加入，再加入酶標抗體、顯色、測OD值，以OD值為1.0時，相應的抗原濃度作為使用效價；②雙方陣試驗比較精確，它既能測出抗原的最適濃度又能測出抗體的最適濃度。即將抗原抗體均稀釋成不同濃度進行酶標抗體反應，以血清稀釋倍數(shù)最高的陰、陽性血清的光吸收值差最大的所對應的抗原稀釋度為抗原的使用效價。
已吸附的抗原的固相載體經(jīng)凍干或干燥保存很穩(wěn)定,數(shù)月仍不失活。
5．清洗液
一般采用0.01Mol/L pH 7.2 PBS吐溫緩沖液。吐溫是聚氧乙烯去水山梨醇脂肪酸酯，為非離子型的表面張力物質(zhì),常做助溶劑。吐溫的編號依聚合山梨醇所結(jié)合的脂肪酸種類不同而定。吐溫20是結(jié)合月桂酸、吐溫40是結(jié)合棕櫚酸、吐溫60是結(jié)合硬脂酸,吐溫80是結(jié)合油酸等。通常用吐溫20加入緩沖液內(nèi)做為濕潤劑,以減少非特異性吸附。也可在PBS緩沖液中加入1%牛血清白蛋白(或10%小牛血清或卵清蛋白),特別在抗原包被以后,以牛血清白蛋白緩沖液再包被一次,而占據(jù)孔內(nèi)剩下位置,這樣來減少非特異性反應。
6．反應時間
抗原與抗體、抗體與酶標抗體反應一般在37℃ 2h～3h達到高峰。時間太短,敏感性下降,時間太長,吸附的抗原或復合物(在這個溫度下)可能脫落。
7．抗體
抗體效價的測定同抗原,采用雙方陣試驗。
酶底物反應時間的確定：一般采用15min～30min～45min。也可以標準陽性血清為準,隨時測定其OD值,當達到規(guī)定的OD值時,即終止反應。
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