NK細(xì)胞無(wú)需抗原預(yù)先致敏，即可快速反應(yīng)并同時(shí)激活免疫系統(tǒng)來(lái)協(xié)同發(fā)揮殺傷作用，堪稱免疫細(xì)胞里的航空母艦�？茖W(xué)家對(duì)NK細(xì)胞療法也寄予厚望，全球的NK細(xì)胞相關(guān)療法也在如火如荼的進(jìn)行著。如何高效利用NK細(xì)胞幫助我們戰(zhàn)勝疾病，科學(xué)家們?yōu)榇艘恢痹谂�力著，今天我們就�?lái)系統(tǒng)的了解一下如何在各個(gè)環(huán)節(jié)提高NK細(xì)胞的純度，以達(dá)到最好的治療效果。
 

Fig1：NK 細(xì)胞的來(lái)源

首先我們需要了解NK細(xì)胞是一種自然免疫細(xì)胞，廣泛存在于人體的外周血、骨髓、脾、淋巴結(jié)等組織中。在細(xì)胞來(lái)源方面，外周血中的NK細(xì)胞含量較高，是常用的來(lái)源之一【1】，另外臍帶血產(chǎn)業(yè)在近幾年迅速發(fā)展，也成為NK細(xì)胞主要來(lái)源之一。除此之外，也可以從人體骨髓、脾、淋巴結(jié)等組織中獲得NK細(xì)胞，但這些來(lái)源的細(xì)胞數(shù)較少，需要經(jīng)過(guò)特殊處理才能得到足夠的細(xì)胞量。

01 血樣采集和處理
首先，需要從健康人體中采集血樣進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。為了避免血液的凝固和失活，建議在血樣采集后盡快進(jìn)行處理。外周血采集建議首選肝素鈉采血管，最好在采血后4小時(shí)內(nèi)安排分離實(shí)驗(yàn)。而采集臍血無(wú)法選用采血管，必須用采血袋，建議使用抗凝劑較少的采血袋（比如100ml的袋子內(nèi)含14ml抗凝保存液），以更大程度防止血鈣流失。血液處理可以使用Ficoll梯度離心分離法（以外周血為例），具體方法如下：
 

Fig2：梯度離心分離法

1、將采集的外周血室溫下進(jìn)行離心處理（操作前請(qǐng)進(jìn)行檢菌），離心15分鐘，離心速度設(shè)置為750g左右。此時(shí)，血液將被分為兩個(gè)層次：上層為血漿，下層為白細(xì)胞、紅細(xì)胞和粘稠物。

2、自體血漿分離

2.1 操作1離心結(jié)束后用移液管將上層血漿轉(zhuǎn)入離心管進(jìn)行密封滅活（血漿放入水浴鍋56℃滅活半小時(shí)），滅活后的血漿置于4℃冰箱半小時(shí)，防止補(bǔ)體、血小板等對(duì)細(xì)胞活化產(chǎn)生影響；

2.2 取出冰箱血漿進(jìn)行再次離心，離心10分鐘，離心速度1000g左右，取上清作為自體血漿置于4℃冰箱備實(shí)驗(yàn)需用。

3、單個(gè)核細(xì)胞PBMC分離

3.1 操作1離心結(jié)束后獲得的血細(xì)胞沉淀用等體積生理鹽水重懸混勻，然后將混勻的血細(xì)胞緩慢加入到離心管中Ficoll層上（確保分層清晰）；

3.2 將離心管放入離心機(jī)進(jìn)行離心處理，離心25分鐘，離心速度930g左右，離心結(jié)束后棄去上清并吸取白膜層細(xì)胞（盡量吸盡液面交界處的細(xì)胞層）

3.3 吸取到的白膜層細(xì)胞放入新的離心管，用生理鹽水重懸混勻定容至100mL并進(jìn)行離心處理，離心8分鐘，離心速度750g；

3.4 可再次洗滌細(xì)胞。棄上清，重懸細(xì)胞，吸取少量細(xì)胞計(jì)數(shù)。調(diào)整細(xì)胞密度后種瓶。

Fig3：NK細(xì)胞毒性測(cè)定