對(duì)于做過(guò)分子實(shí)驗(yàn)的小伙伴來(lái)說(shuō)，傳統(tǒng)的分子克隆技術(shù)——酶切連接，大家應(yīng)該都是比較熟悉的，那么對(duì)于其他的分子克隆技術(shù)類(lèi)型大家有了解過(guò)嗎？根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)需求，來(lái)選擇不同的分子克隆技術(shù)以及產(chǎn)品。本期，小愛(ài)帶大家一起來(lái)了解下幾種常規(guī)的分子克隆技術(shù)吧。
 

酶切連接法屬于經(jīng)典的分子克隆方法，利用限制性?xún)?nèi)切酶切割DNA和利用DNA連接酶連接DNA，最后轉(zhuǎn)化篩選及純化，完成重組基因的大量制備。

圖1 酶切連接流程
 

成功的酶切和有效的連接是分子克隆實(shí)驗(yàn)圓滿(mǎn)完成的必要條件。限制性?xún)?nèi)切酶能特異性地結(jié)合于能被限制性?xún)?nèi)切酶識(shí)別的DNA序列之內(nèi)或其附近的特異性位點(diǎn)上，并切割雙鏈DNA。根據(jù)限制酶的識(shí)別切割特性、催化條件以及是否有修飾酶活性，可分為Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型。分子克隆技術(shù)中最常用的是Ⅱ型酶，切割后得到的是帶粘性末端或平末端的線(xiàn)性DNA。

粘性末端，即限制性?xún)?nèi)切酶在DNA雙鏈上交錯(cuò)切割，形成的核苷酸順序互補(bǔ)的，可形成氫鍵的末端（見(jiàn)圖2）。

平齊末端，限制性?xún)?nèi)切酶在DNA雙鏈的相同位置切割DNA分子，這樣形式的斷裂是形成具有平末端的DNA片斷（見(jiàn)圖3）。

圖2 EcoR I切割DNA形成粘性末端DNA片段

圖3 AluI切割DNA形成平末端DNA片段

核酸片段可以通過(guò)連接酶的作用連接起來(lái)而獲得重組分子。DNA接酶催化雙鏈DNA子中相鄰堿基的5’-P末端與3-0H間形成3’,5’-磷酸二酯鍵。常用的DNA連接酶是T4 DNA連接酶——T4 DNA Ligase，被稱(chēng)為生物界的“502”。在有Mg2+和ATP存在的條件下，T4 DNA Ligase能催化雙鏈DNA或RNA上相鄰的5´-磷酸末端和3´-羥基末端形成磷酸二酯鍵。該酶不僅能夠催化雙鏈DNA的平末端或粘性末端之間的連接，還可以修復(fù)雙鏈DNA、RNA或DNA/RNA雜交雙鏈中的單鏈切刻，但不能催化單鏈DNA之間的連接。

圖4 T4 DNA連接酶作用位點(diǎn)
 

TA克隆是指把PCR片段與一個(gè)具有3‘-T突出的載體DNA連接起來(lái)的方法�？捎糜诓磺宄�目的基因的DNA序列，獲得的目的片段通常需要通過(guò)TA克隆的方法重組到T-載體中，通過(guò)測(cè)序測(cè)定DNA序列。Absin T-Vector快速克隆試劑盒是高效、便利的PCR產(chǎn)物克隆專(zhuān)用試劑盒。

圖5 TA克隆流程
 

無(wú)縫克隆技術(shù)是一種新的、快速、簡(jiǎn)潔的克隆方法，可以在質(zhì)粒的任何位點(diǎn)進(jìn)行一個(gè)或多個(gè)目標(biāo)DNA的片斷的插入，而不需要任何限制性?xún)?nèi)切酶和連接酶，只需要一步重組法，即可得到高效率克隆的重組載體，大大提高了工作效率。Absin快速多片段DNA組裝預(yù)混液(abs60250)就是基于重組原理的無(wú)縫克隆技術(shù)，它不依賴(lài)繁瑣的酶切、連接步驟，也不需要末端補(bǔ)平等操作，依據(jù)DNA片段與線(xiàn)性化載體末端的15~25nt 同源序列的重組，可將插入片段克隆至任意線(xiàn)性載體的任意位點(diǎn)，載體自連背景極低，是一種簡(jiǎn)單、快速、高效的DNA定向克隆技術(shù)。

圖6 Absin快速多片段DNA組裝預(yù)混液（abs60250）無(wú)縫克隆操作流程
 

TOPO克隆實(shí)際是基于拓?fù)洚悩?gòu)酶的克隆技術(shù)，關(guān)鍵是拓?fù)洚悩?gòu)酶。該技術(shù)不需要限制性?xún)?nèi)切酶或外源連接酶，從而提供了將新的PCR產(chǎn)物克隆到質(zhì)粒中的極其簡(jiǎn)便快捷的方法。
 

Geteway克隆利用位點(diǎn)特異重組實(shí)現(xiàn)目的片段的插入的，載體上的一段目的片段在重組酶的作用下會(huì)替換成目的片段，不依賴(lài)限制性?xún)?nèi)切酶和連接酶，導(dǎo)入目的基因不需要開(kāi)環(huán)處理，載體需要用試劑盒提供的載體，一般需要用到兩個(gè)載體，快速、高效將DNA序列轉(zhuǎn)移到載體上的克隆。