開(kāi)始實(shí)驗(yàn)前要問(wèn)的問(wèn)題!

我應(yīng)該使用哪種內(nèi)皮細(xì)胞？

內(nèi)皮細(xì)胞具有高度器官和組織特異性。由于這種異質(zhì)性，不同內(nèi)皮細(xì)胞類(lèi)型的管形成時(shí)間不同。在計(jì)劃實(shí)驗(yàn)時(shí)必須考慮到這一點(diǎn)。通常，低傳代人臍靜脈細(xì)胞 (HUVEC) 用于管形成測(cè)定。

可以應(yīng)用的細(xì)胞類(lèi)型的更多例子是：

• 原代牛主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞 (BAOEC)

• 豬骨髓來(lái)源的內(nèi)皮祖細(xì)胞 (EPC)

• 人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞 (HAEC)

• 人肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞 (HPAEC)

• 人冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞 (HCAEC)

   

哪種細(xì)胞密度最適合我的實(shí)驗(yàn)？

確定正確的細(xì)胞數(shù)對(duì)于從管形成測(cè)定中獲得最佳結(jié)果至關(guān)重要。細(xì)胞密度取決于細(xì)胞類(lèi)型和細(xì)胞大小。在開(kāi)始實(shí)際實(shí)驗(yàn)之前，我們建議在非抑制條件下播種多個(gè)細(xì)胞并對(duì)管形成進(jìn)行成像。創(chuàng)建的管數(shù)最多的細(xì)胞密度將顯示出最明顯的物質(zhì)效應(yīng)，因此應(yīng)該用于實(shí)驗(yàn)。請(qǐng)記住，細(xì)胞通常不會(huì)在凝膠基質(zhì)上增殖。通常，我們建議每孔使用 5,000–10,000 個(gè) HUVEC。

我應(yīng)該使用哪種基質(zhì)膠？

內(nèi)皮細(xì)胞的管形成率取決于形成基底膜樣細(xì)胞外基質(zhì) (ECM) 表面的凝膠的類(lèi)型和成分，細(xì)胞在該表面上接種。市售有幾種基底膜提取物，例如 Matrigel® 和 Cultrex®，它們均由 Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) 小鼠肉瘤細(xì)胞分泌。在開(kāi)始使用特定內(nèi)皮細(xì)胞類(lèi)型進(jìn)行實(shí)驗(yàn)之前，我們建議測(cè)試幾種基底膜物質(zhì)并遵循已發(fā)布的說(shuō)明。如果將在您的測(cè)定中測(cè)試促血管生成劑，則應(yīng)使用減少生長(zhǎng)因子的凝膠基質(zhì)。此外，如果可能，在整個(gè)實(shí)驗(yàn)中使用同一批次。

實(shí)驗(yàn)中應(yīng)包括哪些對(duì)照？

為了對(duì)您的結(jié)果進(jìn)行正確的統(tǒng)計(jì)分析，包括陽(yáng)性和陰性對(duì)照非常重要。作為陽(yáng)性對(duì)照，在不使用任何抑制劑的情況下對(duì)您感興趣的細(xì)胞系進(jìn)行管形成測(cè)定。當(dāng)在生長(zhǎng)因子減少的 Matrigel® 上用饑餓培養(yǎng)基培養(yǎng)時(shí)，內(nèi)皮細(xì)胞應(yīng)在數(shù)小時(shí)內(nèi)顯示管的形成。作為陰性對(duì)照，可以使用不影響細(xì)胞活力的管形成抑制劑。

我的移液器工作準(zhǔn)確嗎？它們是否經(jīng)常校準(zhǔn)？

為避免在使用 µ-Slide 15 Well 3D 時(shí)形成凝膠基質(zhì)的半月板，將 10 µl 的精確量移液至內(nèi)孔至關(guān)重要。此外，正確細(xì)胞數(shù)的播種非常重要。因此，有必要使用經(jīng)過(guò)校準(zhǔn)且處于完美工作狀態(tài)的移液器。我們建議用相應(yīng)的凝膠潤(rùn)濕移液管尖端，然后使用這一尖端填充孔。

康寧Lambda EliteTouch移液器經(jīng)過(guò)精心設(shè)計(jì)，可提供最高水平的舒適性，準(zhǔn)確性和精確度。輕巧的結(jié)構(gòu)，輪廓處理的手柄和4位數(shù)的計(jì)數(shù)器旨在確保舒適的移液，可提供試用。

血管生成載玻片刨面圖
 

我應(yīng)該在哪個(gè)時(shí)間范圍內(nèi)觀察細(xì)胞？

管形成的持續(xù)時(shí)間取決于細(xì)胞類(lèi)型和所使用的細(xì)胞外基質(zhì)，應(yīng)單獨(dú)確定。通常，HUVEC 在 2-4 小時(shí)后已經(jīng)形成管。24 小時(shí)后，細(xì)胞開(kāi)始發(fā)生凋亡，這會(huì)導(dǎo)致與基質(zhì)的分離和管子的破裂。

抑制劑隨時(shí)間對(duì)管形成的影響。
 

我應(yīng)該手動(dòng)還是自動(dòng)監(jiān)控管的形成？

如果有活細(xì)胞成像設(shè)備，我們建議使用延時(shí)視頻成像——尤其是在您不熟悉所用細(xì)胞類(lèi)型的血管生成行為的情況下。在典型設(shè)置中，系統(tǒng)會(huì)在 24 小時(shí)內(nèi)每 5-15 分鐘自動(dòng)拍攝一張照片。這使得能夠精確監(jiān)測(cè)管形成的進(jìn)程，例如，在添加特殊物質(zhì)之后。如果您已經(jīng)知道管形成的大致時(shí)間范圍，也可以在預(yù)期的感興趣時(shí)間點(diǎn)手動(dòng)拍照。

ibidi活細(xì)胞成像系統(tǒng)，直接在顯微鏡上提供生理環(huán)境，在血管生成分析和管形成分析期間實(shí)現(xiàn)活細(xì)胞成像

使用 ibidi Stage Top 孵育系統(tǒng)的活細(xì)胞成像顯示血管生成測(cè)定中 HUVEC 的管形成。

Tube Formation FastTrack AI 圖像分析軟件，ibidi 為管形成分析的量化提供了一種省時(shí)的全自動(dòng)解決方案。它包括循環(huán)計(jì)數(shù)、平均循環(huán)面積、平均管長(zhǎng)度（每個(gè)循環(huán)）、總管長(zhǎng)度和分支數(shù)的分析。

 

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