Trziol法提取RNA所需試劑耗材及實驗操作流程
隨著分子生物技術(shù)在生物學、醫(yī)學等方面的廣泛應用，RNA提取已成為研究基因表達、克隆目的基因等的一項基本試驗技術(shù)。高質(zhì)量RNA的提取，是后續(xù)RT-PCR、qPCR、Northern blot、cDNA文庫構(gòu)建等正常進行的必要前提。Trizol法是一種常見的提取總RNA的方法，在RNA得率及試劑成本方面具有一定的優(yōu)勢。
圖1 Trizol法提取RNA流程
Trizol是一種較為流行的總RNA抽提試劑，可以直接從細胞或組織中提取總RNA。其含有苯酚、異硫氰酸胍等物質(zhì)，能迅速破碎細胞并抑制細胞釋放出的核酸酶，因此對于純化RNA及標準化RNA的生產(chǎn)來說使用價值極高。
Trziol法提取RNA所需試劑耗材清單
圖2
♦ Trizol是動植物細胞、組織或者細菌的總RNA抽提試劑；
♦ 主要含有苯酚、異硫氰酸胍等物質(zhì)，能迅速破碎細胞并抑制細胞釋放出的核酸酶。苯酚主要用于裂解細胞、變性蛋白，同時使部分RNase失活，保護RNA；異硫氰酸胍可降解細胞、溶解蛋白質(zhì)，使蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)消失、使核蛋白與核酸分離，進而使核內(nèi)的RNA被釋放出來，并且抑制RNase活性；
♦ 抽提所得RNA無DNA和蛋白污染。一般所得RNA溶于DEPC水后的A260/280值為8-2.0；
♦ 裂解細胞或和組織共勻漿時，Trizol可以保持樣品中RNA的完整性，即可以有效抑制RNA的降解；
♦ 每一百萬細胞用Trizol抽提可得5-15μg RNA；每毫克組織用Trizol抽提可得1-10μg RNA，產(chǎn)量因細胞和組織不同而異；
♦Trizol抽提所得RNA可直接用于Northern，點雜交，純化mRNA，體外翻譯，RNase protectionassay，cDNA克隆，以及RT-PCR；也可以用于基因表達芯片分析、高通量測序等對RNA質(zhì)量要求較高的情況。
02 / 氯仿
氯仿是分子量比較大的有機溶劑，在提取RNA時，氯仿可以有效的使有機相和無機相迅速分離。加入氯仿，離心后，樣品即分成水樣層（RNA存在于水樣層）、中間層（DNA和蛋白質(zhì)存在于中間層）和有機層。
細化它的主要作用點：
（1）作為有機溶劑變性蛋白，使其沉淀并通過離心除去，同時也通過變性作用抑制RNase活性；
（2）RNA提取試劑中通常含有苯酚（Trizol主要成分就是苯酚），苯酚微溶于水，抽提烷之后水相里有痕量的酚，如果不除去會損傷核酸，需要通過氯仿把水相里參與的苯酚抽提掉；
（3）作為溶劑抽提樣品中的一些脂溶性雜質(zhì)（比如油脂、脂溶性色素等），起到一定除雜作用。
異丙醇的作用主要是沉淀RNA。RNA存在于水樣層中，收集水樣層后可以通過異丙醇沉淀RNA來還原。離心前沉淀不可見，離心棄上清后，可見膠狀的RNA沉淀。
75%乙醇主要由乙醇和DEPC水配置，主要用來洗滌粘附在RNA沉淀上的氯仿跟異丙醇。
DEPC處理水是經(jīng)DEPC（即diethyl pyrocarbonate，焦碳酸二乙）處理過并經(jīng)高溫高壓滅菌的超純水（一級水），是一種無色液體。經(jīng)檢測不含雜質(zhì)RNA、DNA、核酸酶和蛋白質(zhì)。本產(chǎn)品可以用于RNA沉淀的溶解，含有RNA的各種反應體系，以及其它要求無RNase、DNase和proteinase的反應體系。
實驗操作流程
一、細胞裂解
1、組織樣本：
Trizol用量：每50-100mg 組織加1 ml Trizol，樣品體積不應超過Trizol體積的10％。
（1）將動物或植物組織切成小塊，在液氮中磨碎或用勻漿器勻漿處理；
（2）將研磨好的組織粉末快速轉(zhuǎn)入裝有1ml Trizol的2 ml離心管中，在渦旋振蕩器上迅速振蕩混勻，置于冰上，待所有的樣品研磨完；
（3）裂解產(chǎn)物應呈澄清的透明粘稠液體。對于富含蛋白、脂肪或多糖物質(zhì)的組織樣品如肌肉、脂肪組織和植物結(jié)節(jié)部位等，勻漿后仍會存留有不溶物質(zhì)，可于4℃ 12,000 x g 離心10min，然后吸取上清至一新的離心管中。
2、細胞樣本：
（1）貼壁細胞：吸盡培養(yǎng)液，每10cm2培養(yǎng)面積（6孔板單孔或35 mm平皿）加入1ml Trizol，用加樣器吹打數(shù)次，以確保細胞完全裂解，然后轉(zhuǎn)移至離心管中。注：Trizol的使用量應由培養(yǎng)皿表面積決定，而非由細胞數(shù)目決定。Trizol量不足可能導致提取的RNA中有DNA污染；
（2）懸浮細胞：離心收集細胞，吸盡液體，每 5-10×106動植物或酵母細胞，或每 1×107細菌細胞加入1ml Trizol，用加樣器吹打，使其完全裂解，然后轉(zhuǎn)移至離心管中。
注：添加Trizol前切勿洗滌細胞 ，以免RNA降解。必要時可以用勻漿器來裂解某些細菌或者酵母細胞。
（1）裂解產(chǎn)物于室溫放置5min，使核酸-蛋白復合物完全分離；（注：此時樣品可在-80℃長期保存。）
（2）每1ml Trizol加入0.2ml氯仿，蓋緊管蓋，劇烈振蕩15s，室溫放置2-3min；
（3）4℃ 12,000 x g離心15min，樣品會分成三層：桔黃色的下層有機相，中間層和無色的上層水相；
（4）吸取含總RNA的上層水相至一新的離心管中，吸取水相的體積為所用Trizol試劑的60％。
（1）按照每1ml Trizol的最初使用量加入0.5ml異丙醇，顛倒數(shù)次混勻，室溫放置10min；
（2）4℃ 12,000 x g 離心10min，棄除上清，可見膠狀的RNA沉淀；
（3）按照每1ml Trizol的最初使用量加入1ml 75%乙醇，顛倒數(shù)次混勻，洗滌沉淀；
（4）4℃ 12,000 x g離心5min，棄除上清；
（5）室溫倒置5-10min晾干或真空抽干（不要使用真空干燥離心機，以免RNA過干，難以溶解）；
（6）加入適量（如25ul）DEPC-ddH2O或TE緩沖液，用加樣器吹打數(shù)次溶解RNA；
（7）通過RNA電泳以及紫外分光光度計檢測，確定RNA的濃度、純度和完整性；
（8）所得的RNA應立即使用或適量分裝后-80℃保存，避免反復凍融。
