介紹
細(xì)胞系的構(gòu)建是一個(gè)漫長(zhǎng)而乏味的過(guò)程，需要投入大量的勞動(dòng)力和材料。一旦開發(fā)出細(xì)胞系，下游實(shí)驗(yàn)就需要標(biāo)準(zhǔn)化的細(xì)胞接種和均勻的細(xì)胞密度以獲得可量化的結(jié)果。細(xì)胞系開發(fā)的主要挑戰(zhàn)有單克隆性和穩(wěn)健克隆生長(zhǎng)的實(shí)現(xiàn)以及過(guò)程中細(xì)胞的高活性和無(wú)菌性。細(xì)胞系開發(fā)中的這些挑戰(zhàn)可以通過(guò)使用自動(dòng)細(xì)胞分配來(lái)解決，從而在不影響細(xì)胞活性的情況下實(shí)現(xiàn)高通量均勻分配。本研究將使用 FORMULATRIX® 公司的 TEMPEST® 納升級(jí)自動(dòng)分液器將 CHO-K1 細(xì)胞分配至 384 孔板與使用手持電動(dòng)移液器進(jìn)行同樣操作進(jìn)行了比較。
FORMULATRIX 公司的TEMPEST 系統(tǒng)是一款非接觸式高通量試劑分配器，進(jìn)行配置后，能夠通過(guò) 96 個(gè)獨(dú)立控制的噴嘴同時(shí)分配任意體積的多達(dá) 12 種不同的試劑。 TEMPEST 的再循環(huán)功能通過(guò)保持懸浮液的均勻性來(lái)確保細(xì)胞的均勻分配。再循環(huán)功能通過(guò)抑制細(xì)胞沉積來(lái)避免芯片堵塞； 這樣，可以保證最大的細(xì)胞活性。 TEMPEST 基于微隔膜的技術(shù)可以精確分配低至 200 nL 的體積，每個(gè)芯片的死體積為 48 μL，使其有可能適用于在多孔板中接種細(xì)胞。  
材料和方法
細(xì)胞培養(yǎng)和細(xì)胞接種
CHO-K1 細(xì)胞在 F-12K 培養(yǎng)基中貼壁培養(yǎng)。用胰蛋白酶-EDTA 收集細(xì)胞并重懸于培養(yǎng)基中。細(xì)胞兩次通過(guò) 40 μm 細(xì)胞濾網(wǎng)，得到細(xì)胞懸浮液并將其稀釋至 200 個(gè)細(xì)胞/mL。為了每孔接種一個(gè)細(xì)胞，使用 TEMPEST 或手持電動(dòng)多通道移液器將 5 μL 細(xì)胞懸浮液轉(zhuǎn)移到 384 孔板的每個(gè)孔中。
 
活性和接種效率
 為了確定CHO-K1 細(xì)胞過(guò)夜恢復(fù)后的細(xì)胞活性，我們將其制備成細(xì)胞懸浮液（5000 個(gè)細(xì)胞/ml），并使用 TEMPEST 或電動(dòng)移液器以 100μl/孔移液到 384 孔板中，最終實(shí)現(xiàn) 500 個(gè)細(xì)胞/孔的濃度。
 
微孔板成像
 所有實(shí)驗(yàn)的微孔板均使用 Celígo 成像細(xì)胞儀進(jìn)行成像，以獲得細(xì)胞計(jì)數(shù)、實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞接種和隨后的克隆生長(zhǎng)的可視化。我們使用熒光顯微鏡對(duì)細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)，而明場(chǎng)顯微鏡則被用于驗(yàn)證單細(xì)胞的存在和克隆生長(zhǎng)。 圖片拍攝于第 0 天和第 4 天。
 
結(jié)果和討論
單細(xì)胞接種和細(xì)胞克隆生長(zhǎng)
 數(shù)據(jù)顯示，在第 0 天，手動(dòng)接種后 36% (3% CV) 的孔存有單細(xì)胞，而使用TEMPEST得到 32% (2% CV)的孔存有單細(xì)胞，過(guò)程中無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.01，n=3）（圖 1A） )。 監(jiān)測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)進(jìn)一步表明，在第 4 天，手動(dòng)分配時(shí)克隆生長(zhǎng)數(shù)據(jù)為 91%（6% CV），通過(guò) TEMPEST 分配的數(shù)據(jù)為 91%（4% CV），過(guò)程中無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.01，n=3）（圖 1B） 。在第 0 天和第 4 天，通過(guò)視覺(jué)跟蹤監(jiān)測(cè)克隆生長(zhǎng)的比較，可以看到單細(xì)胞生長(zhǎng)成菌落的板孔的掃描圖（圖 2）。 這表明 TEMPEST 在接種單細(xì)胞時(shí)與手動(dòng)使用電動(dòng)移液器的實(shí)驗(yàn)效果一樣好。盡管這兩者的分配機(jī)制非常不同，但 TEMPEST 不會(huì)影響長(zhǎng)期細(xì)胞活性。  
   
活性和接種效率
 使用 TEMPEST 和電動(dòng)移液器進(jìn)行細(xì)胞接種時(shí)，細(xì)胞活性測(cè)量值分別為 97.4%（1.1% CV）和 98.98%（0.7% CV）。 兩個(gè)實(shí)驗(yàn)中的細(xì)胞在接種后恢復(fù)程度相當(dāng)。對(duì)整個(gè)微孔板的細(xì)胞計(jì)數(shù)進(jìn)行比較表明，TEMPEST 具有更好的重現(xiàn)性，CV 為 10%，而電動(dòng)移液器的 CV 為 17%（圖 3）。 TEMPEST 細(xì)胞接種的較低方差體現(xiàn)在其分液體積精度和通過(guò)持續(xù)再循環(huán)維持均勻細(xì)胞懸浮液的能力。
 
手動(dòng)與自動(dòng)液體分配和板孔分析的對(duì)比
 使用 TEMPEST 進(jìn)行分配可將通量提高 25 倍，以此分配細(xì)胞并分析孔中是否存在單個(gè)細(xì)胞。數(shù)據(jù)顯示使用 TEMPEST 系統(tǒng)從手動(dòng)分配的 118 個(gè)樣本/小時(shí)顯著提高為 3008 個(gè)樣本/小時(shí)（圖 4）。 這一結(jié)果不足為奇，因?yàn)?TEMPEST 僅使用一個(gè)芯片便可在大約八分鐘內(nèi)以每孔 100 ul 的速度填充 384 孔板。 如果 TEMPEST 使用所有 12 個(gè)芯片進(jìn)行相同的分配，則此分配時(shí)間會(huì)減少至大約一分鐘。
   
   
總結(jié)
 根據(jù)以上數(shù)據(jù)，我們可以得出結(jié)論，TEMPEST芯片中所使用的微型隔膜泵技術(shù)對(duì)于處理CHO K1細(xì)胞的稀懸液和濃懸液都足夠溫和，與傳統(tǒng)的排氣式移液器沒(méi)有顯著差異。TEMPEST 再循環(huán)功能使懸浮液保持均勻，加上儀器的高分液體積精度，與相同的移液器相比，可降低細(xì)胞接種差異。 TEMPEST 大大縮短了接種時(shí)間，將通量提高了 25 倍。 雖然這項(xiàng)工作是使用 CHO 細(xì)胞和 TEMPEST 進(jìn)行的，但使用有著相同微隔膜技術(shù)的 MANTIS 儀器大概率可以通過(guò)其他細(xì)胞類型或以較低的通量實(shí)現(xiàn)類似的性能，因此這兩款儀器都非常適合基于細(xì)胞的工作流程。