基于信使RNA（mRNA）的治療，簡(jiǎn)單來(lái)講就是化學(xué)修飾后的的mRNA進(jìn)入細(xì)胞后利用細(xì)胞內(nèi)的資源翻譯出機(jī)體所需的蛋白質(zhì)。然而，在mRNA進(jìn)入機(jī)體那一刻到進(jìn)入靶細(xì)胞的過(guò)程中，面臨著穩(wěn)定性、免疫原性、跨越多種生物屏障等的挑戰(zhàn)。為此，研究人員陸續(xù)開(kāi)發(fā)出多種mRNA遞送系統(tǒng)，其中一種主流的遞送方式就是用于制備新冠疫苗的脂質(zhì)納米顆粒（LNP）技術(shù)。目前，除了熟知的疫苗外，通過(guò)蛋白替換、基因編輯等手段，LNP已在代謝疾病、癌癥等治療中展示出巨大的潛力。

在mRNA LNP開(kāi)發(fā)過(guò)程中，明確其藥物代謝動(dòng)力學(xué)（PK）-藥物效應(yīng)動(dòng)力學(xué)（PD）關(guān)系至關(guān)重要。雖然LNP的體內(nèi)暴露是遞送、表達(dá)mRNA的前提條件，但暴露量與表達(dá)效果之間并不存在必然的聯(lián)系。局部注射的mRNA LNP可能會(huì)從注射部位遷移、積聚到機(jī)體的其它組織，高效轉(zhuǎn)染親和力較高的細(xì)胞，將mRNA攜帶的指令兌換成所需蛋白。例如，普遍認(rèn)為肌內(nèi)注射的mRNA LNP主要靶向肌細(xì)胞，但事實(shí)上，在肝臟也能看到相當(dāng)?shù)牡鞍妆磉_(dá)。
為了探討mRNA LNP體內(nèi)分布狀況與PK之間的關(guān)系，來(lái)自上海交通大學(xué)的徐宇虹團(tuán)隊(duì)構(gòu)建了攜帶螢火蟲(chóng)熒光素酶（firefly luciferase）mRNA的LNP并利用DiR或氘代膽固醇進(jìn)行標(biāo)記，通過(guò)生物發(fā)光成像以及熒光素酶活性測(cè)定來(lái)研究mRNA LNP的體內(nèi)表達(dá)情況、DiR熒光成像以及氘代膽固醇含量分析來(lái)追蹤mRNA LNP的體內(nèi)分布情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，雖然經(jīng)肌肉注射進(jìn)體內(nèi)的Fluc-mRNA LNP在注射部位的含量最高，該部位的轉(zhuǎn)染效果不如肝臟、脾臟和淋巴結(jié)，驗(yàn)證了mRNA LNP生物分布與基因表達(dá)之間的非線性關(guān)系。

此外，這些LNP的生物分布、基因表達(dá)受給藥方式、顆粒大小等因素的影響。該研究結(jié)果發(fā)表在國(guó)際期刊《Pharmaceutical Research》上，題目為Biodistribution and Non-linear Gene Expression of mRNA LNPs Affected by Delivery Route and Particle Size。

肌肉注射后，mRNA LNP的體內(nèi)分布狀況
首先，作者將可電離脂質(zhì)H3、HSPC、膽固醇以及DMG-PEG 2000溶解到乙醇中，再把這些脂質(zhì)混合物快速注射到含EZ Cap™ firefly luciferase mRNA的水溶液中，得到Fluc-mRNA LNP。在制備上述脂質(zhì)混合物時(shí)，作者還會(huì)加入熒光染料DiR或氘代膽固醇進(jìn)行標(biāo)記，以便追蹤mRNA LNP的體內(nèi)分布情況。


肌肉組織的熒光信號(hào)隨時(shí)間增加，在第48小時(shí)最強(qiáng)，而肝臟信號(hào)在第7小時(shí)達(dá)到峰值后逐漸減弱。

總體而言，mRNA LNP在體內(nèi)主要分布于肌肉組織，此次是肝臟。同樣地，通過(guò)LC/MS定量分析體內(nèi)不同部位的氘代膽固醇含量，并將每個(gè)部位的LNP%計(jì)算出來(lái)，有60~80% LNP都在肌肉組織，10~20%在肝臟，僅有1~2%在脾臟。

肌肉注射后，mRNA LNP的體內(nèi)轉(zhuǎn)染效果
為了研究上述LNP運(yùn)載的mRNA在聚集部位的釋放情況，作者將編碼卵清蛋白的OVAL-mRNA替代Fluc-mRNA，LNP肌肉注射2小時(shí)后收集肌肉組織，肝臟，引流淋巴結(jié)并使用Cy5標(biāo)記的寡核苷酸探針進(jìn)行原位雜交。

結(jié)果顯示，在注射部位的肌細(xì)胞內(nèi)僅檢測(cè)出微弱的mRNA信號(hào)，而肝細(xì)胞和淋巴細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)尤為清晰。

此外，以同樣的給藥方式將載有Fluc-mRNA的LNP注射到小鼠體內(nèi)后，研究人員不僅在注射部位，在肝臟也檢測(cè)到熒光素酶。熒光素酶活性測(cè)定數(shù)據(jù)（以組織的總重量對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理）表明，Fluc-mRNA LNP在肝臟、脾臟和淋巴結(jié)的表達(dá)水平均高于肌肉組織。

不同給藥方式下，F(xiàn)luc-mRNA LNP的體內(nèi)分布、表達(dá)狀況
接下來(lái)，作者將DiR標(biāo)記的Fluc-mRNA LNP以3種不同的給藥方式注射到小鼠體內(nèi)，并比較了各組小鼠體內(nèi)Fluc-mRNA LNP的分布、表達(dá)狀況。其中，經(jīng)靜脈注射的mRNA LNP主要在肝臟積聚、表達(dá)，生物發(fā)光強(qiáng)度在第4小時(shí)達(dá)到峰值并在注射后48小時(shí)內(nèi)迅速減弱至背景水平。

相比之下，經(jīng)肌肉注射的mRNA LNP雖然有大部分停留在注射部位，但在注射部位和肝臟均能觀察到明顯的生物發(fā)光，而且，生物發(fā)光的時(shí)間、強(qiáng)度較前者慢、弱。至于皮下注射的mRNA LNP，主要在注射部位積聚、表達(dá)，生物發(fā)光強(qiáng)度最弱。

大小各異的Fluc-mRNA LNP的體內(nèi)分布、表達(dá)狀況
除給藥方式外，作者最后還探討了顆粒大小這個(gè)因素對(duì)Fluc-mRNA LNP體內(nèi)分布、表達(dá)的影響。在維持脂質(zhì)組成、mRNA/脂質(zhì)比率不變的前提下，制備了小、中、大3種尺寸的Fluc-mRNA LNP。

肌肉注射后，小的顆粒更容易遷移到肝臟，而大的顆粒會(huì)積聚于注射部位的肌肉組織。有趣的是，盡管小LNP在肝臟的濃度最高，但其轉(zhuǎn)染效果不如中LNP，大LNP效果最差。

總之，該研究揭示了mRNA LNP體內(nèi)分布與基因表達(dá)之間的非線性關(guān)系并明確了與之相關(guān)的影響因素。這些結(jié)果拓展了我們對(duì)mRNA LNP體內(nèi)狀況的認(rèn)識(shí)，有望為高靶向性、高轉(zhuǎn)染效率mRNA LNP的開(kāi)發(fā)提供新思路。