PART1  實(shí)驗(yàn)材料

①

試劑：Hank's液、含10%～20%血清的細(xì)胞培養(yǎng)液、碘酊棉、酒精棉、0.25%胰酶。

②

器材：超凈工作臺(tái)或生物安全柜、細(xì)胞培養(yǎng)瓶、洗耳球。滅菌吸管、平皿、毛細(xì)吸管、離心管、剪刀、小鑷子、CO2培養(yǎng)箱、倒置顯微鏡。

PART2  操作步驟

（1）雞胚的孵育

受精雞胚放在蛋托上，大頭朝上，放入溫箱培養(yǎng)。在溫箱底部放上一盤(pán)水，溫度調(diào)至37.8 ℃。

（2）雞胚的發(fā)育過(guò)程

①觀察方法：將9~12天的雞胚取出，放入平皿中進(jìn)行觀察。

②雞胚的發(fā)育：采用雞胚進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，應(yīng)對(duì)雞胚的發(fā)育有一個(gè)初步了解。雞胚的發(fā)育是由受精卵開(kāi)始的。它在通過(guò)輸卵管時(shí)，已開(kāi)始分裂，當(dāng)產(chǎn)卵時(shí)已在卵黃上部形成一層細(xì)胞稱(chēng)為胚盤(pán)，在適宜的條件下胚盤(pán)繼續(xù)分裂生長(zhǎng)。在發(fā)育過(guò)程中從卵黃和卵白中獲取養(yǎng)料和水分，由于胚體和卵黃分開(kāi)的緣故，胚胎只通過(guò)卵黃帶與卵黃相連。發(fā)育的早期形成3個(gè)胚層，即外胚層、中胚層和內(nèi)胚層，由此形成的胚胎的各個(gè)器官和組織。一般孵育至3天出現(xiàn)尿囊，為直腸側(cè)部分的膨出物，尿囊膜是由內(nèi)胚層和中胚層構(gòu)成的。至第4~5天胚體出現(xiàn)羊膜，尿囊膜及絨毛膜層包被。羊膜系由外胚層和中胚層組成，開(kāi)始時(shí)緊貼于胚體上，后來(lái)腔內(nèi)逐漸充滿(mǎn)羊水。尿囊膜在生長(zhǎng)發(fā)育的過(guò)程中，與絨毛膜相連而成絨毛尿囊膜，此膜由三層細(xì)胞組成：外層為外胚層，內(nèi)層為內(nèi)胚層，中間為中胚層，其中有很多血管，有兩條主動(dòng)脈自卵黃囊延伸到此膜中，與此并行有兩條主靜脈，匯成一較大的尿囊靜脈。絨毛尿囊膜是雞胚的呼吸器官，位于殼膜之內(nèi)。此膜生長(zhǎng)發(fā)育很快，第10 天已包圍了整個(gè)雞胚，此時(shí)雞胚已出現(xiàn)羽毛，呼吸道的發(fā)育在第12~15天出現(xiàn)。胚胎體積逐漸增大時(shí)，胚胎腔外體液日趨減少，孵出小雞時(shí)已無(wú)胚胎腔外體液。在發(fā)育早期，尿囊液及羊水的成分與生理鹽水溶液相差無(wú)幾，12天后羊水的蛋白含量及黏稠度增加，尿囊腔積累了腎臟的排泄物，因此，在12天或13他后，尿囊液由于尿酸鹽的存在，使原來(lái)透明的液體呈現(xiàn)混濁。尿囊液的酸堿度在7~12天期間呈弱堿性，在孵育的末期為pH 6.0。6~13天雞胚羊水的平均量為5~10 mL，至13天有時(shí)可達(dá)10 mL。卵白的水分在發(fā)育的最初7天中轉(zhuǎn)移到卵黃囊內(nèi)，在第16 天卵白轉(zhuǎn)人羊水腔為胚胎所吞食。卵黃在發(fā)育時(shí)逐漸被一層細(xì)胞包圍，自12天以后卵黃逐漸干燥，在孵出之后24~48 h，整個(gè)卵黃囊被吸入小雞腹腔內(nèi)，供維雞出生后最初幾天的營(yíng)養(yǎng)。

（3）雞胚原代的細(xì)胞培養(yǎng)

①消毒：選9~12天的雞胚2~3個(gè)放入超凈工作臺(tái)中，大頭（氣室）朝上放置，先用碘酊棉，消毒氣室部位。

②取雞胚：用鑷子剝?nèi)ヮ^、四肢及內(nèi)臟，洗2~3次，用Hank's液洗去紅細(xì)胞，吸去液體。

③剪碎雞胚及清洗：用小剪刀將雞胚反復(fù)剪碎成泥狀，加Hank's液，吸入細(xì)胞培養(yǎng)瓶，稍靜置，讓組織下沉,吸去液體。用Hank's液洗2~3次,吸去液體，以去除紅細(xì)胞等。

④加胰酶：根據(jù)組織的多少加人一定量的0.25%胰酶，胰酶的量以將組織塊浸泡在胰酶中為適中，一個(gè)雞胚一般加0.25%的胰酶4~5 mL。

⑤消化：用膠塞封緊，輕搖均勻，置4℃冰箱靜置過(guò)夜或37℃水浴消化1 h。

⑥洗去胰酶：消化完畢后，吸出胰酶，用Hank's液或PBS洗3次以洗去胰酶，吸去洗液后。洗時(shí)注意輕搖，如猛烈搖動(dòng)，會(huì)將組織塊搖散，吸去洗液后，用營(yíng)養(yǎng)液將細(xì)胞洗出，放入培養(yǎng)瓶。

⑦計(jì)數(shù)培養(yǎng)：加人適量的培養(yǎng)液(10~20 mL)，用吸管反復(fù)吹打形成細(xì)胞懸液，用細(xì)胞計(jì)數(shù)法，計(jì)算每毫升營(yíng)養(yǎng)液中的細(xì)胞數(shù)，根據(jù)所計(jì)算的細(xì)胞數(shù)，將原液稀釋成106個(gè)/mL。將稀釋好的細(xì)胞懸液接種到培養(yǎng)瓶中，一般200 mL培養(yǎng)瓶，放15~20 mL培養(yǎng)液，節(jié)約時(shí)可放10 mL培養(yǎng)液，培養(yǎng)液的量以覆蓋瓶底為適中。

⑧放入37℃ 、5%CO2溫箱培養(yǎng)：培養(yǎng)時(shí)，培養(yǎng)瓶的蓋不要擰得太緊，以不會(huì)下掉為度，以便CO2進(jìn)入。培養(yǎng)1~2天后長(zhǎng)成單層細(xì)胞，即可應(yīng)用。

PART3  注意事項(xiàng)

1

全部操作過(guò)程應(yīng)在無(wú)菌條件下完成。

2

放入5%CO2溫箱培養(yǎng)的目的是5%CO2能調(diào)節(jié)培養(yǎng)瓶中的pH，使之在一個(gè)星期或更長(zhǎng)時(shí)間pH保持不變。
 

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公司主要研發(fā)生產(chǎn)細(xì)胞系、原代細(xì)胞、胎牛血清、培養(yǎng)基、輔助試劑等系列產(chǎn)品，提供細(xì)胞及培養(yǎng)配套產(chǎn)品一站式采購(gòu)；細(xì)胞庫(kù)凍存細(xì)胞系500余種，同時(shí)通過(guò)不間斷引種細(xì)胞擴(kuò)大豐富細(xì)胞種類(lèi)；公司還提供人源細(xì)胞系的STR鑒定、大小鼠的種屬鑒定服務(wù)等�！　�

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