前言
 

CAR-T細胞療法在血液瘤治療中已被認為是最先進、最有效的策略之一，然而在實體瘤治療中療效并不顯著。其中一個原因主要是由于抑制性細胞因子、低氧環(huán)境和活性氧的存在。使腫瘤周圍形成不利于T細胞的滲透和發(fā)揮作用的腫瘤微環(huán)境。結(jié)合細胞因子的功能優(yōu)勢，靶向腫瘤細胞的第四代CAR結(jié)構(gòu)已經(jīng)被開發(fā)出來并額外釋放有助于T細胞發(fā)揮作用的細胞因子。在CAR-T細胞發(fā)揮作用過程中，細胞因子在免疫細胞的激活、擴增和亞群的極化中起著關(guān)鍵作用。

 

因此本篇文章主要對細胞因子對CAR-T細胞功能的影響、在CAR-T生產(chǎn)過程中的應(yīng)用及臨床效果進行討論。強調(diào)了細胞因子在細胞治療中的重要性。

 

細胞因子對CAR-T細胞功能的影響
 

腫瘤是一種復(fù)雜的組織，除含有腫瘤細胞外，還含有內(nèi)皮細胞、周細胞、炎癥細胞、成纖維細胞以及非細胞成分，如細胞因子、脂類介質(zhì)和細胞外基質(zhì)。在腫瘤微環(huán)境（TME）中，不同的組分能夠通過不同的機制誘導(dǎo)血管生成，促進腫瘤細胞的存活和增殖，并抑制T細胞的抗腫瘤反應(yīng)。

 

腫瘤浸潤性炎癥細胞被腫瘤細胞分泌到腫瘤微環(huán)境的細胞因子所吸引，首先，它們通過產(chǎn)生活性氧、分泌促炎細胞因子和介導(dǎo)細胞毒作用，構(gòu)成了對抗腫瘤的初始防線。然而，當(dāng)這種促炎環(huán)境與TME的慢性炎癥發(fā)展相平衡時，會導(dǎo)致局部組織微環(huán)境轉(zhuǎn)變?yōu)榇龠M腫瘤生長的狀態(tài)。TME細胞利用細胞因子的功能，對免疫細胞的增殖、分化、激活、遷移和存活產(chǎn)生負面影響，構(gòu)成了一個不利的微環(huán)境。因此，細胞因子在調(diào)節(jié)抗腫瘤反應(yīng)、細胞轉(zhuǎn)化和惡性腫瘤的增殖中扮演著重要的角色。

 

1.1   IL-2 and TGF-β

 

TGF-β主要由腫瘤微環(huán)境中兩種免疫抑制細胞即髓系來源的抑制細胞(MDSCs)和調(diào)節(jié)性T細胞(Tregs)分泌，誘導(dǎo)促腫瘤反應(yīng)。Tregs(CD25+Foxp3+)一方面通過分泌TGF-β影響T細胞活性。另一方面通過募集IL-2限制腫瘤微環(huán)境中效應(yīng)性T細胞的擴增。在體內(nèi)，TGF-β通過抑制穿孔素、顆粒酶和干擾素-γ的表達等多種機制，使CD8+和CD4+T細胞增殖和細胞毒T細胞活性的下調(diào)。因此抑制TGF-β在免疫微環(huán)境中的抑制作用，對CAR-T細胞發(fā)揮高效作用具有重要意義。目前溶瘤腺病毒表達TGF-β受體II-Fc融合蛋白與CAR-T聯(lián)合治療乳腺癌模型中已展現(xiàn)加強抗腫瘤效果。

 

1.2   IL-6

 

IL-6被認為是腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中的重要細胞因子。研究表明，不同類型癌癥(如黑色素瘤、結(jié)直腸癌等)患者血清中的IL-6濃度過高與患者的預(yù)后不良有關(guān)。一項研究表明，shRNA-IL-6基因敲除的ssCART-19細胞在注入小鼠體內(nèi)后，導(dǎo)致IFN -γ、TNF、IL-2和IL-17A細胞因子水平升高，而IL-10和IL-6水平下降，對抑制荷瘤小鼠有明顯的增強效果。但在4周后會在大部分組織器官中出現(xiàn)，因此，說明shRNA-IL-6基因敲除的ssCART-19延長了荷瘤小鼠的存活時間，但具有潛在的免疫毒性。因此，更好地了解和利用細胞因子在腫瘤的生物發(fā)生中的作用，對提高CAR-T細胞的治療效果，變得越來越重要。

 

1.3   IFN-γ

 

干擾素-ℽ是一種有效的促炎劑，除了刺激促炎巨噬細胞和誘導(dǎo)Treg細胞凋亡外，它還對腫瘤細胞具有細胞抑制、抗增殖和促凋亡作用，在細胞免疫和抗腫瘤反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。干擾素-ℽ的主要來源是天然免疫細胞、NK細胞和NKT細胞以及獲得性免疫細胞、CD4+和CD8+T細胞。IFN-γ除具有抗腫瘤作用，也可以幫助腫瘤逃脫免疫監(jiān)視，據(jù)報道肝癌、乳腺癌和黑色素瘤模型表明，長期低劑量干擾素ℽ可導(dǎo)致腫瘤生長，并誘導(dǎo)與T細胞活性障礙有關(guān)的分子PD-L1、PD-L2、CTLA-4和Foxp3的表達。結(jié)合IFN-γ的作用，文獻報道了IL-6/IFN-γ雙敲除CAR-T細胞在體外可減少PBMC釋放多種細胞因子，為臨床應(yīng)用提供了一種有希望的策略。

 

細胞因子調(diào)動T細胞實現(xiàn)雙重殺傷
 

最近，帶有啟動T細胞殺傷的細胞因子的新一代CAR-T細胞被開發(fā)出來。這些CAR-T細胞被修飾細胞因子生產(chǎn)盒（可誘導(dǎo)的）。將CAR-T細胞的細胞毒性與細胞因子的原位傳遞聯(lián)系起來，增強CD8+T細胞的細胞毒作用，繞過腫瘤微環(huán)境，更好的調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)。

 

最初Chmielewski等人設(shè)計了癌胚抗原(CEA)特異性的CAR，并修飾表達IL-12分別在體外和體內(nèi)模型中驗證，結(jié)果表明CAR-T細胞分泌IL-12后產(chǎn)生更大的炎癥反應(yīng)，提高T細胞的激活，并招募額外的免疫細胞，如抗腫瘤巨噬細胞到腫瘤微環(huán)境，顯著提高抗腫瘤反應(yīng)。

 

同時，在具有高度免疫抑制腫瘤環(huán)境的卵巢癌中，Koneru等發(fā)現(xiàn)，CAR-T細胞經(jīng)修飾表達IL-12后在體外能更好的抑制卵巢癌細胞的增殖并且干擾素-γ的分泌增加。在體內(nèi)注射后，小鼠存活率明顯提升，干擾素-γ分泌增加，顯示出更強的抗腫瘤效果。

 

此外CAR-T細胞修飾表達IL-7、IL-15、IL-18、IL-22和IL-23等細胞因子也在研究當(dāng)中，以及多種細胞因子共表達目前也備受關(guān)注。巴特拉等在肝癌模型中分別以及聯(lián)合檢測CAR-T細胞修飾表達細胞因子IL-15和IL-21的效果。結(jié)果表明，共表達IL-15和IL-21的CAR-T細胞可以有效的對抗腫瘤細胞。聯(lián)合表達也表現(xiàn)出使CAR-T細胞維持長的存活時間，并且可以維持T細胞因子-1 (TCF-1)的表達，促進T細胞發(fā)育和存活。總體而言，CAR-T細胞中融合表達細胞因子會調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境，招募免疫系統(tǒng)中的其他免疫細胞，促進CAR-T細胞具有更好的持久性和有效性。

 

細胞因子在CAR-T細胞制造過程中的作用
 

CAR-T細胞制造平臺包括四個步驟，細胞因子在最終產(chǎn)品的質(zhì)量和功能中起著核心作用。1. T細胞的分離和富集。CD3+T細胞通常從外周血單個核細胞(PBMC)中獲得或者從白細胞分離中獲得，并通過淋巴細胞分離液離心法進一步分離。2.具體亞型T細胞富集。使用諸如CD3+、CD4+、CD8+、CD25+的磁珠來實現(xiàn)對特定T細胞亞群的富集，也可通過選擇或去除PBMC內(nèi)的特定T細胞類型，使特定T細胞擴增，并以固定的CD4：CD8比率得到最終的細胞產(chǎn)物。3. 基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)。通常是通過病毒載體將相應(yīng)的遺傳信息轉(zhuǎn)移到T細胞，介導(dǎo)T細胞表面CAR的表達�；�于病毒的基因傳遞系統(tǒng)是常用的基因傳遞系統(tǒng)，它們可以達到很高的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。4.擴增CAR-T細胞。通過體內(nèi)培養(yǎng)方法擴增，最后的細胞產(chǎn)品經(jīng)過工藝末期配方并進行超低溫保存。

 

細胞因子對生產(chǎn)CAR-T細胞的T細胞的激活、擴增和質(zhì)量控制起著重要作用。富集的T細胞在特定的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，通常添加IL-2、IL-7、IL-15和IL-21等重要的細胞因子，最常用的兩種CAR-T細胞產(chǎn)生策略是基于IL-2或IL-7細胞因子。正如上文所提到的，IL-2通過上調(diào)穿孔素、顆粒酶B和干擾素-γ促進終末效應(yīng)T細胞的增殖和分化，并抑制記憶細胞marker BCL6和IL7RA的表達。因此，IL-2對T細胞培養(yǎng)尤為重要。然而，IL-2也會促進調(diào)節(jié)性T細胞（Tregs）的擴張，從而抑制CAR-T細胞的抗腫瘤活性。因此IL-2加入的劑要加以摸索。

 

此外，IL-7、IL-15和IL-21的加入可以減少CAR-T細胞的終末分化，增加記憶干細胞的數(shù)量，提高體內(nèi)持久性。據(jù)報道，單獨補充IL-15可以減少耗竭標志物的表達，增加抗凋亡特性，在刺激CAR-T細胞體外擴增、持續(xù)存活和腫瘤殺傷方面表現(xiàn)出類似的效果。IL-7/IL-15加入增強CAR-T細胞的激活并產(chǎn)生較少的耗竭marker。CAR-T細胞中加入IL-2或者IL-15會產(chǎn)生更多的促炎因子，在體外表現(xiàn)出較強的腫瘤溶解能力。總之，CAR-T細胞在離體的生產(chǎn)過程中，必須加入特定的細胞因子，目前的研究主要集中于IL-2、IL-7、IL-15和IL-2，但最佳的細胞因子組成以及在CAR-T細胞生成過程中是否加入其他細胞因子要根據(jù)患者、腫瘤和臨床情況而定。

 

細胞因子釋放綜合征（CRS）
 

CAR-T細胞的使用被認為是一種有效治療腫瘤的方法，但CAR-T細胞注入后的副作用在臨床中也逐漸表現(xiàn)出來。CRS是目前尚未明確闡明的最突出的副作用,根據(jù)臨床試驗，接受CAR-T治療的患者中高達90%會出現(xiàn)CRS，一半的患者進展到3-4級，甚至導(dǎo)致死亡。

 

出現(xiàn)CRS后，血清細胞因子水平、炎癥標志物普遍升高，同時免疫系統(tǒng)被激活。通常CRS發(fā)生在輸液后第1天至第14天之間，臨床表現(xiàn)可能包括發(fā)熱、肌肉酸痛、乏力，并可能進展為缺氧、毛細血管滲漏、重要器官功能障礙等，但大多數(shù)患者能夠自我抵抗這一反應(yīng)。然而，少數(shù)患者需要使用抗IL-6等進行特異性治療。

 

小結(jié)
 

CAR-T細胞療法已被認為是一種突破性的治療方法在血液瘤患者中，然而，在實體瘤中的應(yīng)用仍然有限。然而細胞因子已經(jīng)被證明與涉及CAR-T細胞治療的復(fù)雜過程有著重要的聯(lián)系，因此在CAR-T細胞的基礎(chǔ)上，融合表達細胞因子或在CAR-T細胞生產(chǎn)工藝過程中加入細胞因子有望突破CAR-T在實體瘤治療中的局限和增強在血液瘤治療中的效果。

 

來源：BIG

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