熒光定量PCR是通過檢測(cè)并記錄反應(yīng)體系中熒光信號(hào)的變化來實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，擴(kuò)增曲線是描述PCR動(dòng)態(tài)進(jìn)程的曲線，以循環(huán)數(shù)為橫坐標(biāo)，以反應(yīng)過程中實(shí)時(shí)熒光信號(hào)強(qiáng)度為縱坐標(biāo)。
理論上PCR過程中反應(yīng)產(chǎn)物是以指數(shù)增長(zhǎng)的，但隨著PCR循環(huán)數(shù)的增加，DNA聚合酶失活、dNTP和引物枯竭、反應(yīng)副產(chǎn)物阻礙反應(yīng)等原因，致使PCR的擴(kuò)增效率降低，產(chǎn)物生成的速度逐漸減緩，因此擴(kuò)增曲線是一條“S形”曲線。
擴(kuò)增曲線可以分成四個(gè)時(shí)期：基線期，指數(shù)期，線性期，平臺(tái)期。

基線期：擴(kuò)增曲線的水平部分，擴(kuò)增的熒光信號(hào)被熒光背景信號(hào)所掩蓋，無法判斷產(chǎn)物生成量的變化。
指數(shù)期：PCR指數(shù)擴(kuò)增期，擴(kuò)增曲線起峰，每個(gè)循環(huán)的產(chǎn)物量與初始模板量符合指數(shù)關(guān)系，PCR產(chǎn)物量的對(duì)數(shù)值與起始模板量之間存在線性關(guān)系。
線性期：PCR反應(yīng)后期，由于PCR反應(yīng)體系各成分的消耗、產(chǎn)物抑制等因素的影響，反應(yīng)效率降低，產(chǎn)物量與初始模板量不再符合指數(shù)關(guān)系。
平臺(tái)期：PCR反應(yīng)停止，PCR產(chǎn)物不再隨循環(huán)數(shù)增加而增加。由于影響PCR擴(kuò)增的因素錯(cuò)綜復(fù)雜，每個(gè)反應(yīng)進(jìn)入平臺(tái)期的時(shí)間和平臺(tái)期的高低都各不相同。
 
                                                       Cycles

                                                         擴(kuò)增曲線示意圖
擴(kuò)增曲線中還有幾個(gè)重要的名詞值得注意！
基線（baseline）：由于熒光背景的存在，PCR反應(yīng)的最初3~15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)變化不大，接近一條直線，即為基線。
1、基線可以自動(dòng)生成也可以手動(dòng)設(shè)置，設(shè)置時(shí)需考慮在消除熒光背景的同時(shí)，不能覆蓋非熒光背景的擴(kuò)增信號(hào)。
2、同一次反應(yīng)中對(duì)于不同的基因需要單獨(dú)設(shè)置基線，目前各種熒光定量 PCR軟件的最新版本允許對(duì)單個(gè)樣品自動(dòng)優(yōu)化基線設(shè)置。
閾值（threshold）：在擴(kuò)增曲線的指數(shù)增長(zhǎng)區(qū)域內(nèi)，選擇任意適當(dāng)位置設(shè)定的熒光檢出界限。
1、熒光閾值一般由儀器自動(dòng)設(shè)置，也可以手動(dòng)設(shè)置。熒光域值為基線熒光信號(hào)標(biāo)準(zhǔn)差的10倍。
2、同一次反應(yīng)中對(duì)于不同的基因可單獨(dú)設(shè)置閾值，但對(duì)于同一個(gè)基因擴(kuò)增一定要設(shè)置相同的閾值。
Ct值（Cycle threshold valve）: 指每個(gè)PCR反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。
1、Ct值位于指數(shù)期的開始階段，此時(shí)樣品間細(xì)小誤差尚未放大且擴(kuò)增效率相對(duì)恒定，每個(gè)模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)存在線性關(guān)系。
2、Ct值具有重現(xiàn)性，分析時(shí)一般取15~35，Ct值太大或太小都會(huì)影響定量分析結(jié)果的準(zhǔn)確性。
Ct值的計(jì)算方法有兩種：
1、交點(diǎn)法：通過閾值和擴(kuò)增曲線的交點(diǎn)計(jì)算Ct值，Ct值會(huì)隨閾值的設(shè)定位置不同而發(fā)生變化，實(shí)驗(yàn)間誤差較大。
2、二次曲線峰值法：通過將擴(kuò)增曲線二次求導(dǎo)后取其峰值計(jì)算Ct值，Ct值不會(huì)隨閾值的設(shè)定位置不同而變化，實(shí)驗(yàn)重現(xiàn)性高，同時(shí)能排除儀器檢出誤差的影響。
良好的擴(kuò)增曲線特征：
1、基線期平整——基線平直或略微下降，無明顯的上揚(yáng)趨勢(shì)；
2、指數(shù)期明顯——指數(shù)期起峰，陡度較大，曲線拐點(diǎn)清楚；
3、 曲線整體平滑——線性期慢慢趨于平整，平臺(tái)期基本平整；
4、重復(fù)性好——復(fù)孔間擴(kuò)增曲線的指數(shù)期重復(fù)性較好，Ct值盡量一致，相差最好不要超過0.5個(gè)Ct值。