無血清培養(yǎng)基是指不需要添加血清就可以維持細(xì)胞在體外較長時間生長和增殖的人工合成培養(yǎng)基，簡單的理解就是體外細(xì)胞培養(yǎng)過程中的細(xì)胞培養(yǎng)基不含有動物血清。無血清培養(yǎng)基的基本成分可以分為基礎(chǔ)培養(yǎng)基及添加組分兩大部分。大多數(shù)的無血清培養(yǎng)基含有必須的向細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)離子的轉(zhuǎn)鐵蛋白、調(diào)節(jié)葡萄糖攝取量的胰島素和微量元素（如硒），以及一些蛋白質(zhì)如纖連蛋白、層粘連蛋白、球蛋白、細(xì)胞生長因子等。無血清培養(yǎng)基目前被廣泛應(yīng)用于培養(yǎng)哺乳動物和無脊動物細(xì)胞以制備單克隆抗體、病毒抗原、重組蛋白、疫苗、干細(xì)胞及免疫細(xì)胞治療等多個方面。
 

1.無血清培養(yǎng)基分類及特點(diǎn)

通常而言，無血清培養(yǎng)基包括了無血清培養(yǎng)基、無蛋白無血清培養(yǎng)基、無動物來源的無血清培養(yǎng)基、化學(xué)成分限定培養(yǎng)基等類型。

無血清培養(yǎng)基：是在基礎(chǔ)培養(yǎng)基里補(bǔ)充了一些添加物，包括人激素、牛的轉(zhuǎn)鐵蛋白、牛血清白蛋白等，廣泛的應(yīng)用于多種細(xì)胞系的培養(yǎng)，比如造血細(xì)胞系的培養(yǎng)；

無蛋白無血清培養(yǎng)基：該類培養(yǎng)基完全不含有血清和動物來源的蛋白，但仍包含來源于植物蛋白的水解物或合成多肽片段等其他衍生物。由于所含蛋白極低，并且蛋白成分明確，有利于重組蛋白的下游生產(chǎn)、分離和純化，總體成本也會大幅度下降。但其通用性較差，需要針對目標(biāo)細(xì)胞株進(jìn)行特異性的優(yōu)化。目前主要應(yīng)用于生命科學(xué)研究和基因工程藥物開發(fā)等領(lǐng)域；

無動物來源的無血清培養(yǎng)基：是指以基礎(chǔ)培養(yǎng)基配制的培養(yǎng)液無需添加牛血清，且該培養(yǎng)基成分中不含有任何動物來源成分，即可培養(yǎng)細(xì)胞和維持生長。僅采用蛋白水解物、重組蛋白或其他化學(xué)物質(zhì)來取代動物源蛋白。它既可以滿足細(xì)胞生長及增殖的需要，還能夠降低培養(yǎng)基的生產(chǎn)成本，提高重組蛋白類藥物安全性。目前主要應(yīng)用于生物藥品的研發(fā)和生產(chǎn)中。比如CHO細(xì)胞、293細(xì)胞、Vero細(xì)胞、C6細(xì)胞等；

化學(xué)成分限定培養(yǎng)基：此類培養(yǎng)基完全無血清、無蛋白，成分完全明確，可以保證培養(yǎng)基批次間的一致性。它不但有利于跟蹤細(xì)胞培養(yǎng)的代謝情況，而且在后續(xù)的分離純化中也非常方便，是目前最為安全和理想的培養(yǎng)基。可是并非所有的細(xì)胞都能在化學(xué)成分限定培養(yǎng)基中達(dá)到較高的表達(dá)水平，需要研究者和使用者根據(jù)具體的用途不斷改進(jìn)設(shè)計方案和配方。
 

無血清培養(yǎng)基特點(diǎn)

2.無血清培養(yǎng)基工藝優(yōu)化

優(yōu)化步驟
無血清培養(yǎng)基優(yōu)化首先需要做好實驗設(shè)計方案及獲得信息數(shù)據(jù)的統(tǒng)計方法，這樣可以避免重復(fù)實驗浪費(fèi)資源，并且可以短時間內(nèi)觀察、記錄和評估培養(yǎng)基中添加組分作用效力及組分間的相互影響。

1、篩選：基于市場反饋良好的培養(yǎng)基進(jìn)行篩選，確定分析其重要組分進(jìn)行初步優(yōu)化，可以考慮采用重要組分群單一成分單次驗證測試的方法進(jìn)行初步優(yōu)化�；蛘呖梢钥紤]從待優(yōu)化無血清培養(yǎng)基其重要影響因素中篩選出若干個影響因子，在優(yōu)化階段使用響應(yīng)面分析法確定重要影響因子。

2、優(yōu)化：對于培養(yǎng)基開發(fā)和優(yōu)化實驗設(shè)計中已確定的重要組分進(jìn)行優(yōu)化測試實驗，其中主要優(yōu)化的成分包含基礎(chǔ)培養(yǎng)基、補(bǔ)料培養(yǎng)基及添加物，可以通過響應(yīng)曲面法驗證找出體系中重要組分的優(yōu)化最佳條件。

3、驗證：對優(yōu)化的無血清培養(yǎng)基進(jìn)行放大驗證，與現(xiàn)用培養(yǎng)基及商業(yè)無血清培養(yǎng)基對比測試培養(yǎng)細(xì)胞，比較培養(yǎng)的細(xì)胞生長指標(biāo)與表達(dá)水平。

添加物的選擇
添加物作為培養(yǎng)基的重要組分，我們必須清楚了解添加物對每個細(xì)胞系的影響作用。以相似細(xì)胞系所需要的重要添加物作為參考，可以作為研究點(diǎn)開發(fā)優(yōu)化培養(yǎng)基配方。對于特定的細(xì)胞系，生長因子的需求也是變化萬千的，不過效仿同樣的方法來確定添加組分生長因子也同樣是可行的。

上皮細(xì)胞：常用的生長因子有EGF、皮質(zhì)甾類和視黃醇。細(xì)胞基質(zhì)蛋白包括纖維粘連蛋白（FN）、層粘連蛋白和膠原蛋白也是有益的，能促進(jìn)細(xì)胞粘附。

間充質(zhì)細(xì)胞：生長因子包括酸性/堿性FGF（堿性比酸性更有效）、EGF（或TGFα）、IGF/胰島素（IGF更有效）、PDGF（BB型更有效）和TGFβ（TGFβ在一些情況下起作用，但是對大多數(shù)細(xì)胞來說是生長抑制因子）。其它的添加劑包括鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、皮質(zhì)甾類、細(xì)胞外基質(zhì)蛋白如纖維粘連蛋白、微量元素。

轉(zhuǎn)化細(xì)胞：通常來說，這些細(xì)胞對生長因子的要求比較低。常用的添加劑有IGF/胰島素、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、BSA/肽球蛋白、人轉(zhuǎn)鐵蛋白和微量元素。
 

3.無血清培養(yǎng)基申報要求

近年來，細(xì)胞與基因治療領(lǐng)域（CGT）已成為繼小分子靶向藥物、抗體藥物后最受關(guān)注的生物技術(shù)領(lǐng)域之一，也被業(yè)界當(dāng)前視為生物醫(yī)藥領(lǐng)域內(nèi)的下一個十年黃金賽道。尤其是近幾年在技術(shù)、資本和政策的驅(qū)動下，全球CGT行業(yè)快速升溫，發(fā)展態(tài)勢喜人。在國內(nèi)，CGT賽道的研發(fā)也是在如火如荼地開展著，大量CGT藥物企業(yè)也已申報進(jìn)入了臨床階段。

接下來，和大家分享一些我國政府關(guān)于細(xì)胞與基因治療藥品申報文件中對于培養(yǎng)基的要求。

2015年國家衛(wèi)生計生委辦公廳、國家食品藥品監(jiān)管總局發(fā)布了《干細(xì)胞制劑質(zhì)量控制和臨床前研究指導(dǎo)原則（試行）》，規(guī)定除特殊情況外，應(yīng)盡可能避免在干細(xì)胞培養(yǎng)過程中使用人源或動物源性血清。
 

2016年中國醫(yī)藥生物技術(shù)協(xié)會發(fā)布了《免疫細(xì)胞制劑制備質(zhì)量管理自律規(guī)范》亦有規(guī)定盡量避免異種血清。
 

2017年國家藥監(jiān)局發(fā)布了《細(xì)胞治療產(chǎn)品研究與評價技術(shù)指導(dǎo)原則(試行)》，亦有規(guī)定應(yīng)盡量避免使用血清。
 

2021年國家藥監(jiān)局發(fā)布了《人源性干細(xì)胞產(chǎn)品藥學(xué)研究與評價技術(shù)指導(dǎo)原則》（征求意見稿）亦有規(guī)定避免使用動物源性材料。
 

2022年5月中國藥監(jiān)局發(fā)布了《免疫細(xì)胞治療產(chǎn)品藥學(xué)研究與評價技術(shù)指導(dǎo)原則（試行）》亦有規(guī)定盡量避免使用動物血清、動物來源蛋白質(zhì)。

我國國家藥監(jiān)局等機(jī)構(gòu)總體來說還是禁止使用含有血清的培養(yǎng)基，推薦無血清培養(yǎng)基的應(yīng)用，如細(xì)胞的培養(yǎng)和增殖確實需要用到含有血清的培養(yǎng)基，則必須提供足夠的相關(guān)研究資料，證明使用含有血清培養(yǎng)基的必要性和安全性。

4.小結(jié)

目前，無血清培養(yǎng)基在理論研究和實踐應(yīng)用方面均已取得諸多切實有效的成果，為科學(xué)研究和國民生產(chǎn)做出了卓有成效的貢獻(xiàn)。但是，由于體外培養(yǎng)細(xì)胞的類型具有明顯的多樣性，而現(xiàn)有無血清培養(yǎng)基往往適用范圍較為狹窄，因此亟待需要研發(fā)出普適性強(qiáng)的無血清培養(yǎng)基配方，提高培養(yǎng)的通用性，以能同時滿足不同的要求。

另外，雖然無血清培養(yǎng)基較有血清培養(yǎng)基節(jié)約了血清的成本，但是有些無血清培養(yǎng)基的補(bǔ)充因子價格仍較為昂貴，應(yīng)進(jìn)一步研發(fā)相對廉價而有效的替代品，降低總體培養(yǎng)成本。我們相信，隨著基因工程學(xué)、發(fā)酵工程學(xué)、基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)等技術(shù)的不斷發(fā)展和完善，無血清培養(yǎng)基的開發(fā)和優(yōu)化必將會得到更快的發(fā)展，特別是生產(chǎn)高效性、培養(yǎng)通用性、安全風(fēng)險和降低成本等方面應(yīng)成為今后無血清培養(yǎng)基深入改進(jìn)的重點(diǎn)方向，從而使其能在生物醫(yī)藥行業(yè)和生命科學(xué)基礎(chǔ)研究等領(lǐng)域得到更為廣泛而安全的應(yīng)用。