血清熱滅活？別再浪費時間了！
有必要進行血清熱滅活嗎？
這可能是很多實驗室新手面臨的一個問題。


血清熱滅活目的

• 血清熱滅活目的主要是為了去除血清中補體等對熱敏感的物質(zhì)，但是在胎牛血清中對補體的滅活則明顯沒有必要。

• 研究人員曾對商業(yè)胎牛血清中的補體成分進行測定，他們發(fā)現(xiàn)胎牛血清中含有的C1、C6僅達成年動物血清的1-3%，而其它補體成分僅有成年動物的5-50%，至于補體的主要成分C3在胎牛血清中則幾乎不能檢出。通過補體固定實驗，也未發(fā)現(xiàn)有明顯的溶血現(xiàn)象。多數(shù)實驗室在培養(yǎng)前將培養(yǎng)液進行預(yù)熱的過程，也對熱敏的補體有滅活的作用。
  
   

血清熱滅活非必要

血清熱滅活的步驟在1970年代就已建立，至今成為很多實驗室的常規(guī)血清前處理步驟；但許多先前認(rèn)為必須熱滅活的原因，部分已經(jīng)不再成立：

• 去除支原體污染?
  早期血清加工使用的450 nm濾膜，早已被100 nm濾膜取代；且隨著加工技術(shù)的創(chuàng)新及嚴(yán)格的監(jiān)控，血清產(chǎn)品早已沒有支原體污染的疑慮。

• 去除補體等對熱敏感的物質(zhì)? 
  胎牛血清中含有的補體僅為成年牛血清5-50％，而C3 （補體中引起免疫反應(yīng)的主成分）在胎牛血清中則幾乎不能檢出，直接使用血清對大多數(shù)的細(xì)胞株沒有負(fù)面影響。
  
   

血清熱滅活對細(xì)胞生長無明顯幫助

細(xì)胞生物學(xué)家比較了正常熱滅活胎牛血清對各種細(xì)胞株的生長能力影響，發(fā)現(xiàn)11株細(xì)胞中，熱滅活對6 株細(xì)胞有負(fù)面影響（紅）、3株無影響（綠）、2株有微弱正面改善（黃）（下圖1）。

 

▲圖1：使用未滅活或滅活血清的細(xì)胞生長狀況

 

所以，在正常操作下，熱滅活通常對“細(xì)胞生長”沒有明顯的促進作用，反而會破壞血清內(nèi)生長因子，維生素，氨基酸等珍貴物質(zhì)，降低細(xì)胞增殖速度。

 

血清熱滅活的缺點

萬一設(shè)錯水浴溫度或忘記按計時器，都會導(dǎo)致過高的加熱溫度（下圖2）或過長的加熱時間（下圖3），進而大大降低血清的功能，影響細(xì)胞生長的表現(xiàn)。

 

▲圖２：過高的加熱溫度降低大多細(xì)胞株生長速度

（僅一株未受明顯影響）

 

▲圖３：過長的加熱時間降低大多細(xì)胞株生長速度

（僅一株未受明顯影響）

 

且滅活加熱過程會增加血清的沉淀狀況，而沉淀又常常被誤認(rèn)為是微生物的污染，進而耗費大量時間及精力驗證是否污染，導(dǎo)致實驗一再拖延。

 

 

我的細(xì)胞一定要用滅活血清，怎么辦？

在滅活過程中，除了需要嚴(yán)格監(jiān)測加熱溫度及認(rèn)真計算時間，還有幾個小技巧可以注意噢！

 

• 滅活時，水浴槽水面與血清液面等高。

  使用水浴槽時，大多數(shù)人為避免血清瓶浮起來，會減少水浴槽內(nèi)的水量，讓水面降低；數(shù)據(jù)顯示，降低水面也會使瓶內(nèi)加熱不均、拉長加熱時間（下圖４），增加血清破壞程度；所以還是建議將水浴槽內(nèi)水量增加，讓水面與血清液面等高，讓血清最大面積的接觸水流，增加滅活效率！

 

▲圖４：300ml刻度水位需要60分鐘加溫；

500ml刻度水位僅需40分鐘加溫。

 

至于血清瓶漂浮的問題，套上燒瓶用鉛環(huán)（下圖５）就解決啦！

 

▲圖５：燒瓶用鉛環(huán)

 

• 滅活后，使用冷水浴降溫！　　

  滅活后如果直接放在室溫或4度冰箱冷卻，僅靠空氣傳導(dǎo)散熱，冷卻效果差（下圖６），使得實際降溫時間拉長，對血清的影響較大；反之，流動的冷水浴散熱速度較快，冷卻效果佳，縮短降溫時間的同時，也減少對血清的破壞。

 

▲圖６：比較冷水浴及４℃冰箱降溫速度。

 

本文重點

 

1. 現(xiàn)代血清加工技術(shù)進步，熱滅活已成為非必要步驟。

2. 熱滅活對細(xì)胞生長沒有明顯促進作用，反而會破壞血清、增加沉淀狀況。

3. 除非文獻指出該細(xì)胞必須使用滅活血清，一般細(xì)胞培養(yǎng)可省略血清熱滅活步驟。

4. 如果必須使用滅活血清，加熱時水浴槽水面高度盡量與血清液面等高；滅活后使用冷水浴取代冰箱降溫，能最大程度減少對血清的破壞。直接選擇購買已滅活的血清產(chǎn)品，也是個好選擇噢！

 

總之，非必要不滅活~

 

 

All the Data Come From：

Look, N. (1996). Heat inactivation–are you wasting your time. Art to Science.

 

 

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