攻克原料組分化學(xué)成分難題，實(shí)現(xiàn)生物制藥病毒載體高表達(dá)

引言
1955年Eagle博士發(fā)布細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基配方，并首次指出培養(yǎng)基是“一個(gè)包含無機(jī)鹽、氨基酸、糖、維生素及其他必須營(yíng)養(yǎng)物的等滲透壓且具有pH緩沖能力的混合物”；1959年Eagle博士進(jìn)一步改善了該配方，并將其命名為“Minimal Essential Medium (MEM)”。MEM培養(yǎng)基需要牛血清（10%以上）才能夠發(fā)揮作用。這在細(xì)胞培養(yǎng)基的研發(fā)歷史上，也是劃時(shí)代的里程碑事件！
 

無血清、化學(xué)成分限定培養(yǎng)基開發(fā)意義

當(dāng)前，市場(chǎng)上做培養(yǎng)基的企業(yè)五花八門，既能保證細(xì)胞培養(yǎng)數(shù)量，又能保證細(xì)胞培養(yǎng)活力的培養(yǎng)基也有一些，但是大多含有血清，而這對(duì)于細(xì)胞成藥化和細(xì)胞大批量培養(yǎng)而言，又成為了一個(gè)巨大的門檻。如果細(xì)胞培養(yǎng)基含有外源血清的話，這對(duì)于后期的藥物申報(bào)會(huì)帶來不利影響。因?yàn)榇笈�量培養(yǎng)的細(xì)胞，如果外源血清引入了病毒污染的話，這對(duì)企業(yè)將會(huì)帶來嚴(yán)重的質(zhì)量事故，所以，無血清培養(yǎng)基的開發(fā)已經(jīng)成為了細(xì)胞藥物研發(fā)企業(yè)和細(xì)胞庫運(yùn)營(yíng)企業(yè)亟需解決的重大挑戰(zhàn)！

無血清、化學(xué)成分限定的細(xì)胞培養(yǎng)基優(yōu)勢(shì)有：第一、增加確定性。生物實(shí)驗(yàn)往往需要追根溯源，化學(xué)組分的限定能夠增加試驗(yàn)的確定性，從而更受歡迎。第二、性能更一致。通過確定的配方，可以使每批產(chǎn)品質(zhì)量得到保障，性能更一致。第三、容易進(jìn)行純化和下游加工。部分含血清的培養(yǎng)基，純化工藝較為復(fù)雜。第四、提高制品穩(wěn)定性。成分的確定為培養(yǎng)基的儲(chǔ)存、運(yùn)輸條件、保質(zhì)期限帶來便利，提高了產(chǎn)品的穩(wěn)定性。多方面的優(yōu)勢(shì)，使得無血清、化學(xué)成分限定的培養(yǎng)基將成為未來主流的培養(yǎng)基。
 

293細(xì)胞應(yīng)用領(lǐng)域

復(fù)雜的生物制藥產(chǎn)品生產(chǎn)嚴(yán)重依賴于哺乳動(dòng)物細(xì)胞系，而HEK293因其高轉(zhuǎn)染率和在無血清懸浮培養(yǎng)環(huán)境中快速生長(zhǎng)能力而被廣泛應(yīng)用。主要體現(xiàn)在三個(gè)熱門方向：
①重組蛋白的生產(chǎn)。293真核表達(dá)系統(tǒng)可用于生產(chǎn)具有復(fù)雜翻譯后修飾的重組蛋白，生物活性更接近天然蛋白。
②病毒載體生產(chǎn)。HEK293常用于病毒載體的生產(chǎn)，由于在病毒載體生產(chǎn)過程中存在提供輔助功能的腺病毒E1A/B基因，因此將其用于腺病毒和腺相關(guān)病毒載體的生產(chǎn)，并且懸浮培養(yǎng)更能提高產(chǎn)量。
③腺病毒載體疫苗和溶瘤腺病毒的生產(chǎn)。由于AdVs和AAVs的產(chǎn)生需要HEK293細(xì)胞中腺病毒E1基因的反式互補(bǔ)，而人胚胎腎細(xì)胞HEK293又具有穩(wěn)定生長(zhǎng)，高表達(dá)滴度病毒的優(yōu)勢(shì)，故HEK293細(xì)胞成為其選擇對(duì)象之一，以獲得較高的病毒滴度。

293細(xì)胞是腺病毒載體的包裝細(xì)胞，腺病毒是繼逆轉(zhuǎn)錄病毒和轉(zhuǎn)座子等用于細(xì)胞治療基因修飾的熱門載體。由于直接將腺病毒載體導(dǎo)入人體內(nèi)表達(dá)目的基因，從而可以治療惡性腫瘤、心血管疾病及一些遺傳疾病。利用腺病毒載體在包裝細(xì)胞293中表達(dá)分泌性蛋白質(zhì)，如蛋白酪氨酸、激酶IC等亦成為生產(chǎn)重組蛋白的其中一種途徑。
 

293細(xì)胞作用機(jī)理及培養(yǎng)手段

人胚胎腎細(xì)胞293的商品名為HEK293細(xì)胞，是一個(gè)由人胚胎腎細(xì)胞的細(xì)胞系傳代培養(yǎng)而來，目前在全球范圍內(nèi)廣泛使用的一種經(jīng)典細(xì)胞系，具有轉(zhuǎn)染效率高，易于培養(yǎng)等優(yōu)點(diǎn)。經(jīng)過多年的傳代培養(yǎng)以后，它可細(xì)分為好幾種衍生株，其中293T/17細(xì)胞株的轉(zhuǎn)染效率更好，因此它也成為廣大科研工作者研究基因功能的常用工具。

293T細(xì)胞是293細(xì)胞通過基因技術(shù)派生出的細(xì)胞系，是經(jīng)過腺病毒E1A基因的轉(zhuǎn)染，能表達(dá)SV40大T抗原，含有SV40復(fù)制起始點(diǎn)與啟動(dòng)子區(qū)。許多真核表達(dá)載體如pcDNA3.1中含有SV40病毒的復(fù)制起始位點(diǎn)，可以在表達(dá)SV40病毒T抗原的細(xì)胞系中復(fù)制，從而提高外源基因的表達(dá)水平。因此293T細(xì)胞廣泛應(yīng)用于病毒包裝，并且添加磷酸鈣以后能將轉(zhuǎn)染效率提高50%以上。在蛋白表達(dá)水平高的情況下，轉(zhuǎn)染后2-3天就可以通過堿性磷酸酶分析檢測(cè)到表達(dá)的蛋白。瞬時(shí)轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞是過表達(dá)蛋白并獲得細(xì)胞內(nèi)及細(xì)胞外（分泌的或膜）蛋白的便捷方式。293細(xì)胞在培養(yǎng)過程中的缺陷是生長(zhǎng)過程中貼壁強(qiáng)度較少，在實(shí)驗(yàn)過程中非常容易流失，從而影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。因此，完善293細(xì)胞的大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)具有越來越重要的意義。哺乳細(xì)胞的大規(guī)模培養(yǎng)方式大致分為三種：貼壁培養(yǎng)、微載體培養(yǎng)以及無血清懸浮培養(yǎng)。它在無Ca²⁺或含Ca²⁺培養(yǎng)基中及血清濃度降低的培養(yǎng)基中亦可同樣生長(zhǎng)。如果一個(gè)實(shí)驗(yàn)室所得到的293細(xì)胞是通過郵寄的方式獲取，并且細(xì)胞是存活在培養(yǎng)瓶中的情況。這就需要讓293細(xì)胞靜置一段時(shí)間，降低漂浮在培養(yǎng)液的細(xì)胞數(shù)量。

無血清懸浮培養(yǎng)作為一種人源或動(dòng)物來源的蛋白或激素代替動(dòng)物血清的培養(yǎng)方式，它能減少后期純化工作，提高產(chǎn)品質(zhì)量，因此該方法正逐步成為動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)的研究新方向。要實(shí)現(xiàn)293細(xì)胞無血清懸浮培養(yǎng)必須先將貼壁培養(yǎng)293馴化為懸浮培養(yǎng)293S細(xì)胞并尋找適合高密度無血清培養(yǎng)的培養(yǎng)液配方。懸浮培養(yǎng)時(shí)，由于缺少血清和蛋白的保護(hù)作用，293S對(duì)剪切力的敏感度增加，難以達(dá)到高密度培養(yǎng)，導(dǎo)致293S產(chǎn)生病毒的數(shù)量比貼壁培養(yǎng)低5-10倍左右。細(xì)胞接種后，灌流培養(yǎng)7天，達(dá)到細(xì)胞密度5×10⁶/ml，即可實(shí)現(xiàn)增殖5-10倍。
 

AMMS^® HEK293無血清培養(yǎng)基

隨著生物醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)和生命科學(xué)基礎(chǔ)研究對(duì)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)規(guī)模、效率和安全性能要求的不斷擴(kuò)大和提高，對(duì)生產(chǎn)過程中培養(yǎng)基的使用要求越來越高。大部分生物制藥是利用哺乳動(dòng)物細(xì)胞生產(chǎn)的，細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)是生物制藥生產(chǎn)工藝的核心技術(shù)，而細(xì)胞培養(yǎng)基是細(xì)胞培養(yǎng)的基礎(chǔ)，是生物制藥生產(chǎn)的關(guān)鍵原材料之一。人胚腎細(xì)胞系HEK293及其衍生細(xì)胞系，如293T細(xì)胞，293A細(xì)胞，293E細(xì)胞，293FT細(xì)胞等，被廣泛應(yīng)用于多個(gè)領(lǐng)域，已成為一種強(qiáng)大的載體和新的平臺(tái)，用于生產(chǎn)蛋白質(zhì)、基因治療的病毒載體、溶瘤細(xì)胞藥物、病毒樣顆粒疫苗、病毒載體疫苗等，而在細(xì)胞培養(yǎng)中化學(xué)成分限定的無血清培養(yǎng)基則是實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用的首選�；瘜W(xué)成分限定培養(yǎng)基有利于進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)的代謝及調(diào)控研究，也是工業(yè)生產(chǎn)抗體和重組蛋白的主流培養(yǎng)基。

一款真正化學(xué)成分限定培養(yǎng)基
同立海源AMMS^® HEK293無血清培養(yǎng)基是一款用于 HEK-293 類細(xì)胞懸浮培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染過程的無血清、無蛋白、無動(dòng)物源的化學(xué)成分限定培養(yǎng)基。產(chǎn)品中含有 HEPES、碳酸氫鈉、氨基酸、維生素、酚紅、微量元素、PluronicÒ F-68 等有利于 HEK293 類細(xì)胞 生長(zhǎng)和表達(dá)的組分。產(chǎn)品在使用前需加入 L-谷氨酰胺一起使用。具有為廣大客戶增加實(shí)驗(yàn)確定性、性能更一致等多方面的優(yōu)勢(shì)！
 

圖1：細(xì)胞生長(zhǎng)曲線對(duì)比測(cè)試
 

圖2：細(xì)胞活率曲線對(duì)比測(cè)試

圖3：不同抗體及蛋白表達(dá)對(duì)比

細(xì)胞培養(yǎng)基是以動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)為技術(shù)平臺(tái)，研發(fā)及生產(chǎn)生物藥品的關(guān)鍵原材料之一。生物工藝中細(xì)胞培養(yǎng)基的選擇要兼顧培養(yǎng)基使用性能、監(jiān)管合規(guī)、供應(yīng)安全、下游純化工藝易行性及經(jīng)濟(jì)成本等多層面要求。另外不管是選取哪種培養(yǎng)方式，最重要的一點(diǎn)是注意無菌操作，防止污染。其次在選擇293細(xì)胞適合的培養(yǎng)方式以及有利于其生長(zhǎng)的培養(yǎng)基后，對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)狀況實(shí)行有效監(jiān)控，以便獲得穩(wěn)定的蛋白或病毒產(chǎn)物。