細(xì)胞活性分析

與增殖測定

 

小編前陣子去學(xué)了CPR，第一個(gè)步驟就是要先確認(rèn)倒在那里的人是不是還…活著。
先生先生，你怎么了？（拍拍肩膀）
讓小編開始好奇，我的細(xì)胞“要怎么判斷他們是死是活呢？它們活的好嗎?”

 

 

我們可以簡單將分析細(xì)胞活力和增殖測定的方法分成5大類：

1. DNA合成增殖試驗(yàn)

2. 代謝增殖測定

3. 化學(xué)發(fā)光細(xì)胞活性測定

4. 熒光染料增殖試驗(yàn)

5. 臺盼藍(lán)細(xì)胞計(jì)數(shù)

以下簡單介紹這些分類的幾種常見實(shí)驗(yàn)方式吧！

 

 

01

 DNA合成增殖試驗(yàn) 

✦  +

 BrdU檢測法 

BrdU結(jié)構(gòu)長的跟胸腺嘧啶核苷（Thymine）很像，當(dāng)細(xì)胞生長通過增殖周期-S期（DNA半保留復(fù)制期）時(shí)，BrdU可魚目混珠進(jìn)入新合成的DNA中，因此在加入BrdU后分裂增殖的細(xì)胞都會帶有含BrdU的DNA，可通過抗BrdU單克隆抗體檢測，統(tǒng)計(jì)S期細(xì)胞百分?jǐn)?shù)并計(jì)算細(xì)胞倍增時(shí)間；但BrdU單克隆抗體太大，無法直接與DNA雙股螺旋上的BrdU結(jié)合（胖子上不了螺旋樓梯），所以實(shí)驗(yàn)過程需要將DNA部份變性，使雙股部份解開成單股才能順利檢測，實(shí)驗(yàn)步驟較繁瑣復(fù)雜。

 

 

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 EdU 檢測法 

EdU原理跟BrdU檢測法很像，都是代替胸腺嘧啶滲入正在復(fù)制的DNA中；但能與EdU共軛反應(yīng)的染料分子僅為BrdU抗體的1/500,在細(xì)胞內(nèi)更容易擴(kuò)散，所以不需要變性處理，有效縮減實(shí)驗(yàn)操作時(shí)間，更能避免樣品損傷，反應(yīng)更真實(shí)的細(xì)胞增殖狀況。

 

偵測方法：ICC、IHC、FACS、ELISA

 

 

 

02

 代謝增殖測定 

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 MTT檢測法 

活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶,能使額外添加的MTT還原為不溶于水的藍(lán)紫色結(jié)晶,并沉積在細(xì)胞中，死細(xì)胞則無現(xiàn)象；再利用二甲基亞砜（DMSO）溶解MTT藍(lán)紫色結(jié)晶（Formazan），即可利用酶標(biāo)儀測定光吸收值，并計(jì)算出活細(xì)胞數(shù)量。在一定細(xì)胞數(shù)范圍內(nèi)，MTT藍(lán)紫色結(jié)晶形成的量與細(xì)胞數(shù)成正比。

 

 

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 XTT檢測法 

與MTT原理相似，皆是利用添加物與活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶反應(yīng)，并利用酶標(biāo)儀測定產(chǎn)物光吸收值；不同于MTT法的是，XTT反應(yīng)產(chǎn)物為水溶性橙黃色物，不需經(jīng)過二甲基亞砜（DMSO）溶解步驟，即可直接測定光吸收值，操作較MTT方便快速。

 

 

 

03

 化學(xué)發(fā)光細(xì)胞活性測定 

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 ATP發(fā)光法 

原理是利用外源的螢火蟲熒光素（Luciferin）與熒光素酶（Luciferase），以細(xì)胞內(nèi)含的ATP為能量來源，發(fā)生氧化反應(yīng)產(chǎn)生生物冷光；而ATP是活細(xì)胞的必含物質(zhì)，在細(xì)胞內(nèi)含量恒定，因此可通過監(jiān)測冷光光度，來對應(yīng)ATP含量并判斷細(xì)胞增殖狀況。

 

 

 

04

 熒光染料增殖試驗(yàn) 

✦  +

 CFSE檢測法 

CFSE是一種可穿透細(xì)胞膜的熒光染料，不具有熒光性質(zhì)，而具有細(xì)胞膜通透性，能夠自由進(jìn)入細(xì)胞；當(dāng)CFSE擴(kuò)散穿過細(xì)胞膜，會與細(xì)胞內(nèi)酯酶產(chǎn)生水解反應(yīng)而發(fā)出綠色熒光，這些帶熒光的CFSE會進(jìn)一步與細(xì)胞骨架蛋白結(jié)合，形成穩(wěn)定的胞內(nèi)熒光蛋白。每當(dāng)細(xì)胞進(jìn)行分裂增殖，胞內(nèi)熒光蛋白會被平均分配到下一代細(xì)胞中，因此細(xì)胞熒光強(qiáng)度會隨著增殖代數(shù)增加而不斷的降低，可用流式細(xì)胞儀進(jìn)一步偵測分析得出細(xì)胞分裂增殖的情況。

 

 

 

05

 臺盼藍(lán)細(xì)胞計(jì)數(shù) 

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 臺盼藍(lán)（Trypan Blue）計(jì)數(shù)法 

臺盼藍(lán)是一種藍(lán)色染料，無法通過結(jié)構(gòu)完整的細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部；但細(xì)胞死后，喪失細(xì)胞膜穩(wěn)定性，臺盼藍(lán)會進(jìn)入細(xì)胞將細(xì)胞染成藍(lán)色，因此在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，被常規(guī)的搭配自動細(xì)胞計(jì)數(shù)儀或血球計(jì)數(shù)板應(yīng)用于區(qū)分活細(xì)胞和死細(xì)胞。

 

 

 

當(dāng)然，科技日新月異，
有越來越多更精確的實(shí)驗(yàn)方法等著大家去學(xué)習(xí)研究。
您實(shí)驗(yàn)室都在用什么方法測定細(xì)胞活性呢?