現(xiàn)有的新型生物醫(yī)藥產(chǎn)品中，有相當(dāng)多數(shù)量的生物制劑是通過重組細(xì)胞表達(dá)產(chǎn)生的，其中大部分蛋白質(zhì)，均產(chǎn)生于哺乳動物表達(dá)平臺。由哺乳動物細(xì)胞產(chǎn)生的外源蛋白在活性方面遠(yuǎn)勝于原核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)，因此哺乳動物細(xì)胞作為宿主，被廣泛應(yīng)用于生物制藥的工業(yè)化生產(chǎn)中。近年來除了生物制劑的生產(chǎn)系統(tǒng)已大幅度轉(zhuǎn)向哺乳動物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)外，越來越多科學(xué)家把關(guān)注點(diǎn)轉(zhuǎn)移到哺乳動物細(xì)胞翻譯后修飾與生物制劑的活性，并針對其關(guān)聯(lián)性展開了大量的研究工作。
 

哺乳細(xì)胞表達(dá)分類

 01 

根據(jù)國際人用藥品注冊技術(shù)協(xié)調(diào)會(International Council for Harmonization, ICH)Q5D《用于生物技術(shù)產(chǎn)品及生物制品生產(chǎn)的細(xì)胞基質(zhì)的來源和鑒定》中要求“對于重組產(chǎn)品，細(xì)胞系是指克隆自一個(gè)祖細(xì)胞且含有所需序列的轉(zhuǎn)染細(xì)胞”[1]。

哺乳動物細(xì)胞是表達(dá)人類基因的系統(tǒng)，其優(yōu)點(diǎn)是能夠促進(jìn)蛋白質(zhì)正確折疊，提供準(zhǔn)確的糖基化、乙�；�等多種翻譯后修飾。它能通過構(gòu)建信號肽使成熟的蛋白分泌到胞外，利用親和純化的方式，比較輕松地獲得高活性的蛋白[2]�；�于哺乳動物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)制備的重組蛋白，其高級結(jié)構(gòu)、翻譯后修飾、理化性質(zhì)、生物化學(xué)活性更接近天然的高等生物蛋白質(zhì)分子，被大量用于治療性重組蛋白的生產(chǎn)。根據(jù)目的蛋白表達(dá)的時(shí)空差異，可將哺乳動物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)分為瞬時(shí)、穩(wěn)定和誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)[3]。

●瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)

宿主細(xì)胞在導(dǎo)入表達(dá)載體后不經(jīng)選擇培養(yǎng)，載體DNA隨細(xì)胞分裂而逐漸丟失，目的蛋白的表達(dá)時(shí)間較短。相對于穩(wěn)定表達(dá)系統(tǒng)，瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)無需將外源基因整合到基因組上，避免了外源基因整合過程中位置效應(yīng)的影響。

優(yōu)點(diǎn)：表達(dá)周期短，表達(dá)量高等。

缺點(diǎn)：技術(shù)條件要求高，如質(zhì)粒的純度、轉(zhuǎn)染的效率等。

●穩(wěn)定表達(dá)系統(tǒng)

載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞后，目的基因整合到細(xì)胞基因組上，不會隨著細(xì)胞傳代而消失，能夠長期穩(wěn)定的生產(chǎn)目的蛋白。

優(yōu)點(diǎn)：目的蛋白表達(dá)持久、穩(wěn)定。

缺點(diǎn)：由于需要抗性選擇甚至加壓擴(kuò)增等步驟，穩(wěn)定表達(dá)相對耗時(shí)耗力。

●誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)

目的基因的轉(zhuǎn)錄受外源小分子的誘導(dǎo)，可在特定的時(shí)間或特定的組織、細(xì)胞類型內(nèi)表達(dá)，經(jīng)誘導(dǎo)后目的基因的表達(dá)可大大提高。目前，基于四環(huán)素或多西環(huán)素的調(diào)節(jié)系統(tǒng)以及雌激素受體他莫昔芬系統(tǒng)應(yīng)用較為廣泛。參與誘導(dǎo)調(diào)控的因子與細(xì)胞內(nèi)源性的因子間無相互作用，因此一方面目的基因的表達(dá)本身不受細(xì)胞內(nèi)環(huán)境改變的影響，另一方面誘導(dǎo)藥物對內(nèi)源基因的表達(dá)無作用，因而具有很好的嚴(yán)謹(jǐn)性和特異性。
 

基于哺乳細(xì)胞表達(dá)的細(xì)胞特點(diǎn)

 02 

由于哺乳動物細(xì)胞表達(dá)的細(xì)胞需要穩(wěn)定持續(xù)生長，并且能夠通過外源基因?qū)�入以�?shí)現(xiàn)目的基因的表達(dá)，需要動物組織通過層層篩選、培養(yǎng)優(yōu)化獲得。常用的細(xì)胞系包括HEK293（人胚腎細(xì)胞）和CHO（中國倉鼠卵巢細(xì)胞）這兩種細(xì)胞；均采用懸浮細(xì)胞培養(yǎng)，可以在一個(gè)月內(nèi)產(chǎn)生數(shù)克級蛋白[4]。

然而哺乳動物表達(dá)系統(tǒng)也存在著一定的劣勢，比如實(shí)驗(yàn)成本高、表達(dá)周期長、技術(shù)難度高等。哺乳動物細(xì)胞表達(dá)重組蛋白的最大問題是轉(zhuǎn)染效率不高及所表達(dá)的蛋白質(zhì)水平較低。但隨著如今科研水平的進(jìn)步，HEK293細(xì)胞及CHO細(xì)胞已被分別開發(fā)為有效的瞬時(shí)和穩(wěn)定表達(dá)系統(tǒng)。

以脂質(zhì)體、磷酸鈣或PEI作為轉(zhuǎn)染試劑進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，HEK293細(xì)胞被廣泛用于生產(chǎn)蛋白、疫苗、抗癌試劑及重組腺病毒包被等。HEK293瞬時(shí)表達(dá)相對簡單和容易，但擴(kuò)大規(guī)模卻在技術(shù)上充滿挑戰(zhàn)，而CHO細(xì)胞通常用于穩(wěn)定制備大量重組蛋白。
 

HEK293細(xì)胞和CHO細(xì)胞是在真核蛋白表達(dá)系統(tǒng)中最常用的細(xì)胞，具有以下特點(diǎn)：

①具有準(zhǔn)確的翻譯后修飾功能，表達(dá)蛋白在任何方面都最接近天然狀態(tài)；

②具有重組基因的高效擴(kuò)增和表達(dá)能力；

③具有較高的耐受剪切力和滲透壓能力，表達(dá)水平較高；

④CHO屬于成纖維細(xì)胞，是一種非分泌細(xì)胞，自身很少分泌內(nèi)源蛋白，有利于目的蛋白的分離純化；

⑤HEK293細(xì)胞具有更高的生長密度和更快的生長速度優(yōu)勢，易培養(yǎng)，易轉(zhuǎn)染。

HEK293作為一款全能細(xì)胞，在病毒生產(chǎn)和重組蛋白生產(chǎn)中有著舉足輕重的地位。但現(xiàn)階段科研實(shí)驗(yàn)中，最常用的生物藥學(xué)蛋白制備宿主卻是CHO。在所有哺乳動物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)中目前有70%的重組蛋白生物制劑源自于CHO，小鼠骨髓淋巴瘤細(xì)胞（NS0和Sp2/0）已獲批用于西妥昔單抗（cetuximab）和帕利珠單抗（palivizumab）等抗體的商業(yè)化生產(chǎn)，人胚腎細(xì)胞HEK293已獲批用于凝血因子Fc融合蛋白商業(yè)化生產(chǎn)[5]。

CHO如此受歡迎，原因是其擁有極高的生產(chǎn)力（批量培養(yǎng)0.1-1g/L，分批培養(yǎng)1-10g/L），并且表現(xiàn)出持續(xù)良好的生長表型，適合大規(guī)模工業(yè)化培養(yǎng)，容易適應(yīng)各種化學(xué)成分限定的培養(yǎng)基，不易被人類病毒感染，能夠進(jìn)行人類兼容的糖基化等諸多優(yōu)點(diǎn)。

統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，近十年中有超過一百多種市場價(jià)值預(yù)計(jì)達(dá)1400億美元的生物制藥產(chǎn)品在美國和歐盟獲得批準(zhǔn)并銷售。這些獲批銷售的產(chǎn)品有很大一部分是重組蛋白，其中使用哺乳動物表達(dá)平臺的比例在不斷增加。2016-2020年，有超過 80% 在美國和歐洲市場獲批的重組蛋白生物藥物是通過培養(yǎng)的哺乳動物細(xì)胞生產(chǎn)的。2018 年十大暢銷藥物（包括傳統(tǒng)藥物和生物藥）中有8種是在培養(yǎng)的哺乳動物細(xì)胞中生產(chǎn)的重組蛋白。
 

真核哺乳細(xì)胞應(yīng)用

 03 

CHO細(xì)胞：基于哺乳動物細(xì)胞的早期生物藥

1987 年中國倉鼠卵巢 (CHO) 細(xì)胞源性的組織纖溶酶原激活劑 (Activase®) 獲批用于治療心肌梗塞，開啟了利用哺乳動物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)生物藥的時(shí)代。在過去的幾十年里，用于生產(chǎn)生物藥的哺乳動物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)中，CHO 細(xì)胞已成為生物制藥行業(yè)的主力。從 1987 年到2021年2月，通過培養(yǎng)的哺乳動物細(xì)胞生產(chǎn)的獲批生物藥中有 81% 是使用CHO細(xì)胞生產(chǎn)。
 

1987年至2021年2月用于生物藥商業(yè)規(guī)模生產(chǎn)的哺乳動物細(xì)胞系類型百分比。
 

抗體相關(guān)生物藥
1987年至2021年期間，歐盟和美國共批準(zhǔn)了超過 207 種哺乳動物細(xì)胞源性生物藥[6]。在這類獲批的哺乳動物細(xì)胞源性生物藥中，單克隆抗體已成為生物制藥市場的重要推動力，成為增長最快的創(chuàng)新點(diǎn)和收入來源。已獲批準(zhǔn)的四種主要抗體類型是鼠抗體、嵌合抗體、人源化抗體和完全人源抗體。

由培養(yǎng)的哺乳動物細(xì)胞生產(chǎn)的生物藥包括激素、酶、細(xì)胞因子、凝血因子、Fc融合蛋白和抗體。從1987年到2021年2月批準(zhǔn)的大多數(shù)基于哺乳動物細(xì)胞的生物藥是抗體，在生物制藥市場中約占58%。其中，嵌合、人源化和全人源單克隆抗體三大類構(gòu)成了約98%的抗體產(chǎn)品。

HEK293細(xì)胞：重組治療性蛋白和疫苗的生產(chǎn)
Drotrec-ogin alfa (Xigris®)是第一個(gè)基于HEK293細(xì)胞系生產(chǎn)的重組治療性蛋白質(zhì)，并在2001年獲得批準(zhǔn)，2002年被FDA和EMA批準(zhǔn)用于治療膿毒癥患者。隨后，美國和歐盟批準(zhǔn)了4種基于HEK293細(xì)胞生產(chǎn)的藥物，包括Efmoroctocog alfa (Eloctate®)、Human-cl rhFVIII (Nuwiq®)、 Eftrnonacog alfa (Alprolix®)、Dulaglutide (TrulicityTM)。
 

HEK293細(xì)胞還被用于制造腺病毒疫苗，用于基因治療、預(yù)防接種和癌癥治療。作為首個(gè)基因治療藥物，Recombinant human AdV-p53 (Gendicine)于2003年獲得CFDA批準(zhǔn)，用于聯(lián)合化療治療頭頸部鱗狀細(xì)胞癌患者。此外，2010年完成了在HEK293細(xì)胞中生產(chǎn)的MRKAd5HIV-1gag/pol/nef疫苗(ClinicalTrials.gov，NCT00849680)和VRC-HIVADV014-00-VP疫苗(ClinicalTrials.gov，NCT00119873)的臨床試驗(yàn)。

基因工程重組蛋白藥物是新藥開發(fā)的重要發(fā)展方向之一，如今重組蛋白藥物雖然僅占全球處方藥市場的7%-8%，但其發(fā)展速度不可小覷。1989年重組蛋白藥物的銷售額為47億美元，到2005年達(dá)到410億美元，幾乎是1989年的9倍。其中排名前10位的藥物占銷售額的60%以上，血液病、腫瘤、中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病及感染疾�。ㄈ绨�滋病等）藥物占據(jù)重組蛋白藥物市場絕大部分份額。

十九世紀(jì)八十年代中期，自從重組哺乳動物細(xì)胞系第一次被報(bào)道，細(xì)胞系的構(gòu)建得到了快速的發(fā)展。未來科研人員對重組蛋白生產(chǎn)的研究，有望在重組蛋白藥物開發(fā)方面取得快速進(jìn)展，使得我們獲得更可行、更高效的重組蛋白類生物藥物。雖然重組蛋白藥物生產(chǎn)條件嚴(yán)苛，服用流程復(fù)雜且價(jià)格昂貴，但對于某些疾病卻有著不可替代的治療作用。未來中國生物制藥領(lǐng)域仍將以重組蛋白為主流，這與世界生物制藥領(lǐng)域的發(fā)展趨勢吻合，相信哺乳動物細(xì)胞將在重組蛋白藥物研制過程中發(fā)揮更重要的作用。

同立海源生物具備十余年中試工藝生產(chǎn)經(jīng)驗(yàn)，擁有哺乳動物細(xì)胞表達(dá)蛋白質(zhì)工程平臺，公司生產(chǎn)的真核重組蛋白產(chǎn)品具有翻譯后修飾功能，更好的維持了天然蛋白構(gòu)相、活性更高、效果更好、穩(wěn)定性強(qiáng)，同時(shí)滿足客戶個(gè)性化定制服務(wù)需求。制藥級生產(chǎn)車間及藥用包材，保障了產(chǎn)品高性能和高穩(wěn)定性，支持細(xì)胞藥物臨床申報(bào)，助力生物制品制造。
 

參考文獻(xiàn)：

[1] International Council for Harmonisation. Q5D: derivation and characterisation of cell substrates used for production of biotechnological/biological products [EB/OL]. Switzerland: ICH, 1997 [2018-12-31].https://www.ich.org/page/quality-guidelines.

[2] Gray D. Overview of protein expression by mammalian cells. Curr Protoc Protein Sci. 2001 May;Chapter 5(1):Unit5.9. doi: 10.1002/0471140864.ps0509s10. PMID: 18429190; PMCID: PMC7162368.

[3] Hacker DL, Balasubramanian S. Recombinant protein production from stable mammalian cell lines and pools. Curr Opin Struct Biol. 2016 Jun;38:129-36. doi: 10.1016/j.sbi.2016.06.005. Epub 2016 Jun 17. PMID: 27322762.

[4] Tihanyi B, Nyitray L. Recent advances in CHO cell line development for recombinant protein production. Drug Discov Today Technol. 2020 Dec;38:25-34. doi: 10.1016/j.ddtec.2021.02.003. Epub 2021 Apr 12. PMID: 34895638.

[5] Hu J, Han J, Li H, et al. Human Embryonic Kidney 293 Cells: A Vehicle for Biopharmaceutical Manufacturing, Structural Biology, and Electrophysiology. Cells Tissues Organs. 2018;205(1):1-8. doi: 10.1159/000485501. Epub 2018 Feb 1. PMID: 29393161.

[6] R.Al-Majmaie, D.Kuyestermans, M.Al-Rubeai, Biopharmaceuticals Produced from Cultivated Mammalian Cells. Cell Culture Engineering and Technology, Cell Engineering 10, 2021.