淺談細(xì)胞培養(yǎng)三大步驟

 

01 

復(fù) 蘇

細(xì)胞復(fù)蘇的原則：快速融化

 

必須將凍存在-196℃液氮中的細(xì)胞快速融化至37℃，使細(xì)胞外凍存時(shí)的冰晶迅速融化，避免冰晶緩慢融化時(shí)進(jìn)入細(xì)胞形成再結(jié)晶，對(duì)細(xì)胞造成損害。

 

 

實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備

1. 將水浴鍋提前預(yù)熱至37℃。

2. 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行常規(guī)消毒，用75％酒精擦拭紫外線照射40min的超凈工作臺(tái)臺(tái)面，保證無菌。

3. 在超凈工作臺(tái)中按次序擺放好消過毒的離心管、吸管、培養(yǎng)瓶等即將使用的耗材及試劑。

 

取出凍存管

1. 根據(jù)細(xì)胞凍存記錄按標(biāo)簽找到所需細(xì)胞的對(duì)應(yīng)編號(hào)。

2. 從液氮罐中取出細(xì)胞盒，取出所需的細(xì)胞，同時(shí)核對(duì)管外的編號(hào)。

 

迅速解凍

1. 迅速將凍存管投入到已經(jīng)預(yù)熱的水浴鍋中迅速解凍，并要不斷的搖動(dòng)，使管中的液體迅速融化。

2. 約1-2min后凍存管內(nèi)液體完全溶解，取出用酒精棉球擦拭凍存管的外壁，再拿入超凈臺(tái)內(nèi)。

 

平衡離心

用架盤天平平衡后，放入離心機(jī)中3000r/min 離心3分鐘。

 

制備細(xì)胞懸液

1. 吸棄上清液。

2. 向離心管內(nèi)加入適量完全培養(yǎng)液，吹打制成細(xì)胞懸液。

3. 用培養(yǎng)液懸液混懸沉淀細(xì)胞，細(xì)胞計(jì)數(shù)調(diào)整細(xì)胞濃度，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

 

細(xì)胞計(jì)數(shù)

細(xì)胞濃度以5×10⁵/ml為宜。

 

培養(yǎng)細(xì)胞

將符合細(xì)胞計(jì)數(shù)要求的細(xì)胞懸液分裝入培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，將培養(yǎng)瓶放入37℃，5％CO₂的培養(yǎng)箱內(nèi)2-4h（或者24-48h）后換液繼續(xù)培養(yǎng)培養(yǎng)，換液的時(shí)間根據(jù)細(xì)胞情況而定。

 

記錄復(fù)蘇日期

 

 

 

結(jié)果分析

 

 

判斷細(xì)胞復(fù)蘇成功與否，需要看復(fù)蘇后細(xì)胞貼壁率及細(xì)胞存活率（細(xì)胞存活率將凍存管內(nèi)剩余的細(xì)胞，臺(tái)盼藍(lán)染色法檢測(cè)復(fù)蘇細(xì)胞的存活率。呈藍(lán)色的細(xì)胞為死細(xì)胞，活細(xì)胞不著色。用細(xì)胞計(jì)數(shù)板和計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)細(xì)胞，得出細(xì)胞存活率）。

 

如果復(fù)蘇后95%以上的細(xì)胞貼壁，而且細(xì)胞的活性好，這就說明細(xì)胞復(fù)蘇的過程沒有問題。復(fù)蘇的細(xì)胞恢復(fù)到正常生長(zhǎng)，達(dá)到正常的生長(zhǎng)特性（比如細(xì)胞群體倍增時(shí)間等）后要再凍存以補(bǔ)充細(xì)胞儲(chǔ)存數(shù)量。

 

 

 

××  初學(xué)者易犯錯(cuò)誤  ××

 

 

• 水浴鍋未提前預(yù)熱或者未預(yù)熱到37℃直接融化。

• 水浴鍋內(nèi)凍存管太多，導(dǎo)致傳熱不佳，使融化時(shí)間延長(zhǎng)。

• 離心前忘記平衡，導(dǎo)致離心機(jī)損壞和細(xì)胞丟失。

• 一次復(fù)蘇細(xì)胞種類過多，忘記更換吸頭和吸管，導(dǎo)致細(xì)胞交叉污染。

 

02 

傳 代

01

傳代密度過高

一旦細(xì)胞養(yǎng)太久至融合度過高（>90%）才傳代，容易使細(xì)胞產(chǎn)生老化現(xiàn)象，甚至是堆疊，再消化細(xì)胞時(shí)不易吹打成單顆細(xì)胞，即便再重新鋪盤傳代，細(xì)胞也無法回到原本的特性了。（如：?jiǎn)螌蛹?xì)胞，沒長(zhǎng)滿就發(fā)生堆疊現(xiàn)象）。

解決方案

盡量避免融合度過高，鏡下觀察融合度約達(dá)到80%即可傳代分盤。

細(xì)胞融合度：在細(xì)胞培養(yǎng)中指的是細(xì)胞在培養(yǎng)表面（培養(yǎng)皿/瓶）所占的比例。

 

02

傳代密度過低

哺乳動(dòng)物貼壁培養(yǎng)細(xì)胞，若細(xì)胞培養(yǎng)到80-90%密度需要開始傳代，在傳代接種細(xì)胞密度過低，細(xì)胞間距離太遠(yuǎn)，就無法在細(xì)胞間產(chǎn)生黏附及通信作用，幫助信號(hào)傳導(dǎo)并活化細(xì)胞；總體細(xì)胞量不足，分泌的生長(zhǎng)因子濃度會(huì)不足以產(chǎn)生利于生長(zhǎng)的微環(huán)境，以上皆會(huì)造成增殖速度遲緩或細(xì)胞死亡。

解決方案

細(xì)胞傳代時(shí)，要進(jìn)行準(zhǔn)確的細(xì)胞計(jì)數(shù)，確保鋪盤的密度。

 

如何確定細(xì)胞的正確初始接種密度? 

美國(guó)細(xì)胞庫(kù)（ATCC）建議各類不同細(xì)胞株接種密度：

 

細(xì)胞類型	接種密度
常見腫瘤細(xì)胞株	2-4 x 106 viable cells/625px2
成纖維細(xì)胞株	2-4 x 106 viable cells/25cm2
淋巴細(xì)胞/懸浮細(xì)胞	3-4 x 105 viable cells/ml
雜交瘤	2 x 105 viable cells/ml
成肌細(xì)胞	1-2 x 104 viable cells/cm2

https://www.atcc.org/support/faqs/8e032/Seeding%20Density%20for%20Cell%20Lines-25.aspx

 

 

03 

凍 存

細(xì)胞凍存的基本原理：慢凍

 

手動(dòng)降溫：將細(xì)胞依序放在4℃（30分鐘）、-20℃（1小時(shí)）、-80℃（過夜）后移至液氮中保存。

 

程序降溫盒：是一般最廣泛使用的降溫法，為一種特制冷凍容器（填充異丙醇或依靠特制金屬導(dǎo)熱），使細(xì)胞以每分鐘約-1℃的速度降至-80℃（過夜），然后移至液氮中保存。

由此可以看出，程序降溫精準(zhǔn)度更高，優(yōu)于手動(dòng)降溫。

 

	程序降溫	手動(dòng)降溫
優(yōu)點(diǎn)	主動(dòng)監(jiān)控溫度 一些控制速率的冷凍機(jī)不需要任何可消耗的制冷劑	不需要任何特殊器皿 成本低
缺點(diǎn)	受控速率凍結(jié)裝置 適當(dāng)?shù)拇鎯?chǔ)瓶 專門的冷凍溶液	專門的冷凍溶液 -80℃冷凍機(jī) 液氮罐
長(zhǎng)時(shí)間保存	液氮或低溫儲(chǔ)存（只要低于-135℃即可）	液氮

 

大家可以根據(jù)自身情況或者實(shí)驗(yàn)條件選擇不同的凍存方式。

 

細(xì)胞凍存是細(xì)胞保存的主要方法之一。利用凍存技術(shù)將細(xì)胞置于-196℃液氮中低溫保存，可以使細(xì)胞暫時(shí)脫離生長(zhǎng)狀態(tài)而將其細(xì)胞特性保存起來，這樣在需要的時(shí)候再?gòu)?fù)蘇細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。而且適度地保存一定量的細(xì)胞，可以防止因正在培養(yǎng)的細(xì)胞被污染或其他意外事件而使細(xì)胞丟種，起到了細(xì)胞保種的作用。

 

細(xì)胞代謝過程需要各種蛋白酶的參與，而這些蛋白酶在環(huán)境溫度低于-70℃時(shí)會(huì)集體罷工，低溫貯藏的目的是通過超低溫使代謝活動(dòng)近乎停止。細(xì)胞因此進(jìn)入休眠狀態(tài)，使細(xì)胞“不會(huì)老”，可以長(zhǎng)期保存。

 

因?yàn)閮鋈谶^程對(duì)所有細(xì)胞和組織都是有一定傷害的，因此，需要開發(fā)出有效的技術(shù)來防止細(xì)胞死亡和損傷。

 

 

這時(shí)，低溫保護(hù)劑就發(fā)揮出它的作用了。

 

低溫保護(hù)劑可保護(hù)細(xì)胞不受細(xì)胞內(nèi)冰凍影響，目前多采用DMSO、甘油、乙二醇和丙二醇等滲透型低溫保護(hù)劑。它們的作用機(jī)制包括：自由進(jìn)入細(xì)胞，取代水，使冰點(diǎn)下降，充當(dāng)鹽的二次溶劑，提高細(xì)胞膜對(duì)水的通透性。

 

但是，部分低溫保護(hù)劑在緩慢冷凍過程中雖然會(huì)保護(hù)細(xì)胞，但它們也會(huì)引起細(xì)胞毒性，尤其是在室溫下。因此，在標(biāo)準(zhǔn)的自制凍存液中，會(huì)含有血清，血清是用來降低細(xì)胞毒性的，但血清也不是完美的。

 

血清的優(yōu)勢(shì)	血清的缺點(diǎn)
有助于保護(hù)細(xì)胞	含有生長(zhǎng)因子，激素等未知成分
	不推薦用于細(xì)胞庫(kù)，臨床應(yīng)用
	增加污染幾率
	成本波動(dòng)

 

 

如何選擇凍存液

 

 

首先我們需要明確首要任務(wù)是什么？我們的細(xì)胞需要什么？

• 高回收率？

• 高存活率？

• 注重低溫保存培養(yǎng)基成分？

• 需要無血清或無外源性要求？

• 商業(yè)培養(yǎng)基相比于自制培養(yǎng)基的優(yōu)勢(shì)？

 

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