2012年鐵死亡被發(fā)現(xiàn)后，它的相關(guān)研究經(jīng)歷了指數(shù)級的增長，也是近幾年熱門中的 “熱門”。小優(yōu)曾用3篇文章詳細(xì)的剖析過它，從研究歷程到正式命名，再到通路研究，都有詳細(xì)解讀，不清楚的同學(xué)可以戳鏈接再了解。

在今年的3月17日，美國Broad研究所Todd R. Golub研究組與Peter Tsvetkov合作在Science上發(fā)表了題為“Copper induces cell death by targeting lipoylated TCA cycle proteins” 的研究文章。文章一經(jīng)發(fā)布，“銅死亡”一詞迅速霸屏�？梢灶A(yù)見，未來幾年，銅死亡的相關(guān)研究，也會迎來“井噴式”爆發(fā)。

為了方便各位快速了解銅死亡，大家拿好小板凳做好，小優(yōu)課堂馬上就要開課了。

本文核心觀點：
1. 揭示了一種新的細(xì)胞死亡機(jī)制——銅死亡，證明銅誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡是由蛋白質(zhì)脂�；�所介導(dǎo)的 
2. 銅死亡是通過銅與TCA循環(huán)的脂�；�成分直接結(jié)合而發(fā)生的，這導(dǎo)致脂�；�蛋白質(zhì)聚集，以及鐵硫簇蛋白質(zhì)丟失，從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)毒性應(yīng)激并最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡
3. FDX1是蛋白質(zhì)脂�；�的上游調(diào)節(jié)因子，F(xiàn)DX1和蛋白質(zhì)脂�；�是銅死亡的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子

Over！接下來讓我們細(xì)細(xì)研磨這篇文章的精華，感受高分文章的魅力所在吧！

銅是所有生物體必不可少的輔助因子，通過跨濃度梯度起作用的主動穩(wěn)態(tài)機(jī)制可以將細(xì)胞內(nèi)銅濃度保持在非常低的水平，以防止對細(xì)胞有害的游離銅的累積。不過銅穩(wěn)態(tài)的遺傳變異會導(dǎo)致致命的疾病，并且銅離子載體和銅螯合劑都被認(rèn)為是抗癌劑。然而，過量的銅如何誘導(dǎo)細(xì)胞死亡尚不清楚。

銅離子載體是與銅結(jié)合的小分子，可以將銅運(yùn)送到細(xì)胞內(nèi)，因此是研究銅毒性的有用工具。多條證據(jù)表明，銅離子載體誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的機(jī)制涉及細(xì)胞內(nèi)銅的積累，而不是小分子伴侶本身的作用。

一、銅離子載體誘導(dǎo)一種獨特形式的受調(diào)節(jié)的細(xì)胞死亡

為了確定銅離子載體的細(xì)胞毒性是否依賴于銅本身，研究人員首先利用Elesclomol這種銅離子載體驗證了僅有銅離子能夠介導(dǎo)細(xì)胞的死亡，而搭載其他金屬離子時不具備對細(xì)胞殺傷的活性。接下來驗證了銅離子介導(dǎo)細(xì)胞死亡的機(jī)制，通過凋亡的標(biāo)志物檢測，以及凋亡或鐵死亡的抑制劑均不能抑制銅離子所介導(dǎo)的細(xì)胞死亡，這表明銅離子載體誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡很可能是一種新的細(xì)胞死亡途徑，明顯區(qū)別于傳統(tǒng)的凋亡、鐵死亡和壞死等細(xì)胞死亡方式。

圖1：銅離子載體誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡與傳統(tǒng)死亡途徑不同

A：在489個細(xì)胞系中測試了1448個載銅藥物對細(xì)胞的殺傷效果，結(jié)果表明這些載銅藥物均能殺傷細(xì)胞
B：單獨加入Elesclomol不影響細(xì)胞的生長，而一旦加入銅離子，細(xì)胞生長受到極大抑制。相反，加入其他金屬，例如鐵鈷鋅鎳等也不影響細(xì)胞生長
C：用濃度低至40nM的銅離子載體Elesclomol脈沖處理，2ｈ細(xì)胞內(nèi)銅水平增加15至60倍，超過24小時后引發(fā)細(xì)胞死亡。該結(jié)果表明銅介導(dǎo)的細(xì)胞死亡確實受到調(diào)節(jié)
D、E：Elesclomol誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡不涉及caspase 3活性的切割或激活
F、G：當(dāng)細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵效應(yīng)子BAX和BAK1被敲除或當(dāng)細(xì)胞與泛半胱天冬酶抑制劑共處理時，Elesclomol仍能誘導(dǎo)細(xì)胞死亡，再次表明銅誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡與細(xì)胞凋亡不同
G、H：銅誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡與已知細(xì)胞死亡機(jī)制不同

二、線粒體呼吸調(diào)節(jié)銅離子載體誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡

研究人員觀察到更依賴線粒體呼吸的細(xì)胞對銅離子的敏感性比進(jìn)行糖酵解的細(xì)胞高近1000倍。如果采用藥物干預(yù)線粒體功能后，細(xì)胞對銅離子的敏感性發(fā)生顯著變化。通過乏氧條件培養(yǎng)細(xì)胞，研究人員進(jìn)一步證實了銅誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡需要線粒體呼吸參與，而糖酵解產(chǎn)生的ATP方式，對銅誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡影響較小。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，用銅離子載體處理不會顯著降低基礎(chǔ)呼吸或ATP相關(guān)呼吸，但會顯著降低呼吸的儲備能力，這表明銅不直接靶向ETC，而是靶向TCA循環(huán)的組成部分。

圖2：線粒體呼吸調(diào)節(jié)銅離子載體誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡

A：更依賴線粒體呼吸的細(xì)胞對銅離子的敏感性比進(jìn)行糖酵解的細(xì)胞高近1000倍
B：用線粒體抗氧化劑等處理，對銅離子載體的敏感性具有非常明顯的影響。ETC的復(fù)合體I/II的抑制劑以及線粒體丙酮酸攝取的抑制劑能減少細(xì)胞死亡，但對鐵死亡沒有影響
C：線粒體解偶聯(lián)劑FCCP對銅毒性沒有影響，這表明銅誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡需要線粒體呼吸
D：低氧條件下，銅誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡減弱，進(jìn)一步強(qiáng)調(diào)了細(xì)胞呼吸在介導(dǎo)銅誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡中的作用
E：銅不直接靶向ETC而是靶向TCA循環(huán)的組成部分
F：銅離子載體誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡和線粒體代謝之間的聯(lián)系

三、FDX1和蛋白硫辛酰化是銅離子載體誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子

為進(jìn)一步研究銅離子和 TCA 循環(huán)之間的聯(lián)系，研究人員使用 CRISPR-Cas9 技術(shù)，分別敲除不同的基因，再使用銅離子載體處理細(xì)胞，以確定涉及參與銅離子載體誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的基因。結(jié)果發(fā)現(xiàn)有7個基因的敲除可以明顯緩解銅離子載體介導(dǎo)的細(xì)胞殺傷作用，包括 FDX1，LIPT1、LIAS、DLD (硫辛酸途徑的三個關(guān)鍵酶)，DLAT、PDHA1、PDHB (丙酮酸脫氫酶復(fù)合體的三個組分)。另外，敲除 FDX1 和 LIAS 基因明顯減輕銅離子載體引起的細(xì)胞毒性，這進(jìn)一步加強(qiáng)了FDX1和銅誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡之間的功能聯(lián)系，也因此，研究人員猜測 FDX1 有可能是蛋白質(zhì)硫辛�；�修飾的上游調(diào)節(jié)因子。

圖3：FDX1 和蛋白硫辛酰化是銅離子載體誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子

A-C：敲除了不同基因后，細(xì)胞參與銅離子載體誘導(dǎo)的死亡的基因（藍(lán)色）
D：硫辛酸通路的示意圖
E：代謝酶篩選顯示，復(fù)合物I的基因抑制也使細(xì)胞免于銅誘導(dǎo)的死亡
F、G： FDX1和LIAS的缺失賦予了對銅誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡的抵抗力

四、FDX1 是蛋白質(zhì)硫辛�；�的上游調(diào)節(jié)因子

為了驗證上述猜測，研究人員首先通過檢索公共數(shù)據(jù)庫，發(fā)現(xiàn)FDX1和硫辛酸代謝相關(guān)蛋白在銅離子載體誘導(dǎo)細(xì)胞死亡方面是高度相關(guān)的。其次，對208例人類腫瘤樣本進(jìn)行了FDX1和硫辛�；�蛋白的免疫組織化學(xué)染色，發(fā)現(xiàn)FDX1和硫辛�；�蛋白的表達(dá)高度相關(guān)。之后，通過免疫印跡和免疫組織化學(xué)檢測，發(fā)現(xiàn)敲除FDX1會導(dǎo)致DLAT 和 DLST 蛋白的硫辛酰化完全喪失，同時也導(dǎo)致細(xì)胞呼吸水平顯著下降。這些結(jié)果均表明FDX1是蛋白質(zhì)硫辛�；�的上游調(diào)節(jié)因子。

圖4：FDX1 是蛋白質(zhì)硫辛�；�的上游調(diào)節(jié)因子

A：FDX1 敲除的相關(guān)基因網(wǎng)絡(luò)
B-C：腫瘤樣本的 FDX1 和硫辛�；�蛋白的免疫組化染色
D：敲除 FDX1，檢測硫辛酰化蛋白的表達(dá)量
E：敲除 FDX1 ，檢測細(xì)胞耗氧率
F：敲除 FDX1，檢測與硫辛酰化途徑相關(guān)的代謝物的變化

五、銅直接結(jié)合并誘導(dǎo)硫辛�；� DLAT 的寡聚化

上述實驗已經(jīng)建立了銅毒性和蛋白質(zhì)硫辛�；�之間的聯(lián)系，但沒有確定直接的機(jī)制。有研究報道銅離子與游離脂酸的解離常數(shù)為 10–17，這表明銅離子有可能直接與硫辛�；�蛋白結(jié)合。

為了驗證這一猜想，研究人員純化了DLAT和DLST蛋白，發(fā)現(xiàn)二者都可以與偶聯(lián)銅的樹脂結(jié)合。而敲除FDX1會導(dǎo)致DLAT蛋白的硫辛酰化修飾消失，且 DLAT和DLST也不再與偶聯(lián)銅的樹脂結(jié)合。這表明蛋白質(zhì)的硫辛酰化修飾是結(jié)合銅的必要條件。此外，銅與硫辛�；�蛋白 DLAT 的結(jié)合，會導(dǎo)致蛋白的寡聚化，而 Elesclomol 處理會增加 DLAT 蛋白的寡聚化。

圖5：銅直接結(jié)合并誘導(dǎo)硫辛�；� DLAT 的寡聚化

A：細(xì)胞提取蛋白和偶聯(lián)銅的樹脂的結(jié)合
B-E：IB 分析 DLAT 蛋白寡聚化
F-H：強(qiáng)還原劑TCEP處理，表明寡聚體是二硫鍵依賴性的

六、銅誘導(dǎo)細(xì)胞死亡機(jī)制與銅穩(wěn)態(tài)失調(diào)的遺傳模型相同

為了探討與銅離子載體治療相關(guān)的銅毒性機(jī)制是否與這些自然發(fā)生的銅穩(wěn)態(tài)失調(diào)有關(guān)，研究人員檢查了三個實驗?zāi)Ｐ�。首先，在HEK 293T和ABC1細(xì)胞中過表達(dá)SLC31A1，這顯著增加了對生理銅濃度的敏感性。另外，過表達(dá) SLC31A1 的細(xì)胞被銅離子載體處理后，蛋白硫辛�；瘻p少，F(xiàn)e-S簇蛋白水平降低，HSP70 水平升高。

在過表達(dá)SLC31A1的細(xì)胞中，鐵死亡、壞死性凋亡和凋亡抑制劑并不能阻止銅誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡，而銅螯合劑、FDX1敲除和LIAS敲除各自部分卻可緩解銅離子載體產(chǎn)生的細(xì)胞殺傷作用。

最后，使用老年 ATP7B 缺陷小鼠 (Atpb7b−/−，銅失調(diào)綜合征 Wilson’s disease 模型) 與雜合子 (Atpb7b+/−) 和野生型對照小鼠對比，發(fā)現(xiàn) ATP7B 缺陷小鼠的肝臟中蛋白的硫辛�；�水平和 Fe-S 簇蛋白的含量均有顯著降低，Hsp70 蛋白則有明顯增加。多種模型證明銅穩(wěn)態(tài)失調(diào)導(dǎo)致的細(xì)胞死亡和銅離子載體誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡是同一種機(jī)制。


圖6：銅誘導(dǎo)細(xì)胞死亡機(jī)制與銅穩(wěn)態(tài)失調(diào)的遺傳模型相同

E、F：過表達(dá)SLC31A1，CuCl2 處理細(xì)胞
G、H：用 Nec-1 等處理過表達(dá) SLC31A1 的細(xì)胞，加入 CuCl2，檢測細(xì)胞活力
I、J：天然細(xì)胞內(nèi)銅伴侶谷胱甘肽的消耗導(dǎo)致銅依賴性細(xì)胞死亡，這可以在LIAS敲除后緩解
K：檢測 Atpb7b-/- 小鼠與對照組肝臟的蛋白質(zhì)含量

七、總結(jié)

前面我們已經(jīng)分析過細(xì)胞凋亡、焦亡、自噬、程序性壞死以及鐵死亡等，相關(guān)信號通路解讀、文章和視頻講座等資源都匯總到了小優(yōu)的學(xué)術(shù)中心的細(xì)胞死亡大合集，有需要的戳鏈接自取呦。在此項研究中，作者證明了一種與現(xiàn)有已知的所有細(xì)胞死亡機(jī)制都不相同的新機(jī)制，取名為銅死亡（Cuprotosis）。

銅死亡依賴于線粒體呼吸——銅離子通過直接結(jié)合三羧酸循環(huán)途徑中的硫辛�；�蛋白，導(dǎo)致硫辛�；�蛋白異常聚集，并干擾呼吸鏈復(fù)合體中的鐵硫簇蛋白，引起蛋白質(zhì)毒性應(yīng)激反應(yīng)，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。在此過程中，F(xiàn)DX1和參與蛋白質(zhì)硫辛酰化的六個基因是促進(jìn)銅誘導(dǎo)死亡的關(guān)鍵基因，這些基因?qū)�線粒體有氧代謝至關(guān)重要。

圖7：銅死亡機(jī)制示意圖

在疾病研究方面，多種癌癥(包括乳腺癌、肺癌、胃腸道癌、口腔癌、甲狀腺癌、膽囊癌、卵巢癌和前列腺癌)患者的腫瘤或血清中，銅水平會異常升高。過量銅積累會危及生命，但可能存在一個窗口，使得細(xì)胞內(nèi)銅的更集中增加可用于選擇性殺死癌細(xì)胞。新近發(fā)現(xiàn)的銅死亡為銅與癌癥的關(guān)系提供了思路。銅離子載體Elesclomol可結(jié)合環(huán)境中存在的銅并將其帶入細(xì)胞以誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。Elesclomol 可能在表達(dá)大量硫辛�；�線粒體蛋白和高度呼吸的癌癥中效果最好。這種方法可能對天然抵抗細(xì)胞凋亡的癌癥特別有用，通過利用這種金屬的獨特作用，可以找到一種殺死癌細(xì)胞的新方法。

基于銅的抗癌機(jī)制，目前銅螯合劑和銅離子載體在多種腫瘤中已進(jìn)行臨床前及臨床研究。其中銅螯合劑四硫鉬酸鹽（TTM） 、ATN-224 在乳腺癌中已經(jīng)入II期臨床試驗。銅離子載體雙硫侖（DSF）治療惡性膠質(zhì)瘤進(jìn)入II期臨床試驗，Elesclomol治療黑色素瘤也進(jìn)入了II期臨床試驗。